筇竹組培快繁技術1)

鄭靜楠 董文淵 鐘歡 尹澤南 吳義遠

(云南省林業調查規劃院，昆明，650051) (西南林業大學)

筇竹(Qiongzhueatumidinoda)為地下莖復軸混生的小型竹種，被列為國家三級保護的珍稀瀕危竹種之一[1]，僅分布于中國的西南部分地區。筇竹具有極高的觀賞、工藝、營養、生態和經濟價值[2-4]。適宜筇竹生長的生態環境被長時間破壞，加劇了筇竹資源的衰退，其常規繁殖常采用扦插,繁殖系數較低,且易造成病毒的積累,而通過組培技術可在短期內獲得大量健康苗木。對筇竹的組培技術進行研究,為今后科學化、規模化培育筇竹林提供一定的理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

試驗材料為筇竹成熟種胚。

1.1 試劑及設備

自動雙重純水機、冰箱、自動高壓蒸汽滅菌(YAMATO，SQ810C)、體視鏡(Nikon，ECLIPSE E100)、顯微鏡(Feica，MDG33)、電子天平、超凈工作臺(蘇凈安泰)、紫外燈車(上海躍進)、恒溫箱、培養皿等實驗室常用儀器設備。

試驗試劑；植物生長調節劑為2，4-D、KT、6-BA、NAA、IBA；MS大量元素、MS微量元素、鐵鹽、MS有機物、升汞、瓊脂、酒精、次氯酸鈉。

1.2 研究方法

1.2.1 試管苗無菌體系的建立

將挑選后并去外稃的種子，置于超凈工作臺上，設計9種滅菌消毒的方法，進行試驗[5-8]。

方法1：體積分數75%酒精(浸泡)10 min→無菌水沖洗5次→體積分數0.1%升汞(8 min)→無菌水沖洗5次→吸干水分→接種。

方法2：體積分數75%酒精(浸泡)10 min→無菌水沖洗5次→體積分數0.1%升汞(15 min)→無菌水沖洗5次→吸干水分→接種。

方法3：體積分數75%酒精(浸泡)10 min→無菌水沖洗5次→0.2 mL氯酸鈉(浸泡)15 min→無菌水沖洗5次→體積分數0.1%升汞(8 min)→無菌水沖洗5次→吸干水分→接種。

方法4：體積分數0.2%次氯酸鈉(2 h)→體積分數75%酒精(15 min)→體積分數0.1%升汞(8 min)。

方法5：體積分數0.5%甲醛(2 h)→體積分數75%酒精(15 min)→體積分數0.1%升汞(8 min)。

方法6：體積分數0.2%次氯酸鈉(12 h)→體積分數75%酒精(15 min)→體積分數0.1%升汞(8 min)。

方法7：體積分數0.5%甲醛(12 h)→體積分數75%酒精(15 min)→體積分數0.1%升汞(8 min)。

方法8：體積分數2.5%次氯酸鈉(2 h)→體積分數75%酒精(15 min)→體積分數0.1%升汞(8 min)。

方法9：體積分數2.5%甲醛(2 h)→體積分數75%酒精(15 min)→體積分數0.1%升汞(8 min)。

種子消毒后，將種子置于接種盤上進行解剖，選取筇竹種胚為外植體，接種于空白MS，pH值為5.6～5.8的培養基中，每種消毒方法接種于3組培養基中，每組設置15個組培瓶，每個組培瓶接種1顆種子，共45顆，培養條件為(25±1)℃、光照2 000 lx、光照時間12 h·d-1，觀察記錄各處理的種子在接種5、12、20 d的污染和萌發情況。

1.2.2 試管苗叢芽誘導

以筇竹種胚作為外植體，接入叢芽誘導培養基中進行誘導培養。誘導培養基以MS，pH值5.6～5.8為基礎培養基，生長調節劑選用6-BA1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-15個質量濃度水平和NAA0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-15個質量濃度水平，自由組合(表1，表2)，為25個自由組合進行試驗，篩選適宜叢生芽誘導的生長調節劑種類及配比，每個處理接種45瓶，每瓶1個種胚，每個處理重復3次[9-15]。培養條件同上，30 d左右進行觀察和統計叢芽誘導結果。

表1 不同植物生長調節劑的叢生芽誘導

1.2.3 叢生芽增殖培養基篩選

為了使叢生芽得到大規模、快速繁殖，需要在原代培養叢生芽的基礎上進行繼代增殖。由于各種植物生長調節劑之間可能存在相互作用，以MS培養基、6-BA質量濃度、NAA質量濃度、KT質量濃度為4因素，每個因素3水平L9(34)進行正交設計方案，探索更為準確的叢生芽增殖配方[16-21]。設置9個處理，每個處理重復3次，30 d后統計結果，具體設計方案見表3和表4。取誘導出的長勢一致的無菌叢芽，接于提前配置好的培養基中，每瓶接1叢，每組25瓶，每個處理重復3次。

表2 誘導叢生芽的設計方案

表3 不同植物調節劑對叢芽增殖影響的試驗設計

表4 叢芽增殖試驗設計方案L9(34)

1.2.4 生根誘導

以1/2MS作為基礎培養基，添加不同質量濃度和配比的6-BA、NAA和IBA植物生長調節劑組合設計到培養基中。其中植物生長調節劑6-BA質量濃度分別為0.3、0.5、0.8 mg·L-1；NAA質量濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg·L-1；IBA質量濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg·L-1(表5)。通過3因素3水平正交設計L9(33)(表6)，每瓶接種一個筇竹苗叢，每個處理接種25瓶，重復3次，詳見表6。在前一階段的繼代培養中選取分化長2.0 cm以上的無根筇竹小苗，接種于表6的生根培養基中誘導生根，試圖找到最佳的生根壯苗試驗配方[21-24]。

表5 不同植物調節劑生根誘導的試驗設計

表6 不同植物調節劑生根壯苗的正交設計方案

1.2.5 煉苗移栽

將組培瓶瓶蓋打開，置于常溫室內自然散射光下進行煉苗，煉苗3～5 d后，選擇挑選生長良好、根系完整的組培苗取出，洗凈根部附著的瓊脂，以腐殖土、珍珠巖和河沙為原料，配置3種不同的基質(表7)，然后將組培苗從組培瓶中移栽到不同基質中。30 d后觀測記錄成活率及生長情況，比較不同基質對移栽成活率的影響。

表7 移栽基質及其組成成分

2 結果與分析

2.1 外植體無菌體系的建立

由于筇竹種子被稃葉包裹，胚位于果基部，消毒液不易浸入，加之稃葉易生長各種霉菌。在選用了3種組培常用的基本消毒方法基礎之上再設置了5種消毒方法處理，分別接種到MS空白培養基上，20 d后統計污染與成活率(表8)。

由表8可知，單一組織消毒方法的效果較組合消毒試劑浸泡處理后的效果差，消毒試劑浸泡后，污染率隨之降低。為了進一步證明不同處理對筇竹外植體的影響，對污染率、萌芽率及成活率進行分析，效果詳見表8。

從表8可以看出，隨著所使用消毒試劑種類、質量濃度及浸泡時間的增加，材料污染率隨之降低，但萌芽率及成活率也受到了影響；用體積分數0.2%的次氯酸鈉對種子進行浸泡比直接用酒精浸泡效果好，原因是酒精對種胚有一定的刺激作用，產生傷害；用體積分數0.2%次氯酸鈉和體積分數0.2%甲醛浸泡比體積分數2.5%次氯酸鈉和體積分數0.2%甲醛浸泡效果好，研究發現，高體積分數浸泡可使污染率降低，但萌芽率和成活率顯著下降；使用體積分數0.2%次氯酸鈉和體積分數0.5%甲醛浸泡12 h和浸泡2 h萌芽率和成活率差異不大，但浸泡12 h后污染率卻顯著降低；且使用體積分數0.5%甲醛的萌芽率和成活率比體積分數0.2%次氯酸鈉高，污染率低，對種胚的傷害也相對較小，整體效果好。

結果表明，單用酒精、次氯酸鈉、甲醛、升汞中的任何一種試劑的效果比組合使用消毒效果差。因此，滅菌消毒的方法7為最佳消毒方式，即采用體積分數0.5%甲醛(12 h)→體積分數75%酒精(15 min)→體積分數0.1%升汞(8 min)的處理效果為理想，種胚污染率為3.33%，萌芽率為86.21%，成活率為83.33%。

2.2 不同生長調節劑對叢芽誘導的影響

筇竹叢芽經過不同生長調節劑30 d的誘導，不同質量濃度6-BA對筇竹萌芽率、叢芽誘導率有一定的影響(表9)，隨著6-BA質量濃度的增加，種胚萌芽率呈下降趨勢，叢芽誘導率先增加后減少。當6-BA質量濃度為2.0 mg·L-1時萌芽率、叢芽誘導率為最高。

由表10可知，不同質量濃度6-BA對叢芽種胚叢芽誘導率影響差異顯著，對萌發率影響差異不顯著。

表9 不同質量濃度6-BA對叢芽萌芽率和誘導率的影響

表10 不同質量濃度6-BA對叢芽誘導的方差分析

表11 不同質量濃度NAA對萌芽率、叢芽誘導率的影響

由表11、表12可以看出，不同質量濃度的NAA對筇竹的萌芽率、叢芽誘導率的影響均差異不顯著，當NAA質量濃度為0.2 mg·L-1時的萌芽率、叢芽誘導率最高。由此得出，筇竹叢芽誘導率同時受到種胚的萌芽率和叢芽誘導率指標的影響，基于叢芽誘導率考慮，可以將MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA看作較好的試驗組合，該組合叢芽誘導率最高，為66.67%。

表12 不同質量濃度NAA對筇竹叢芽誘導的方差分析

2.3 不同植物生長調節劑組合對筇竹叢生芽增殖的影響

取長勢良好的筇竹試管叢生苗接入表4的不同處理的培養基中，30 d后記錄統計叢生芽增殖倍數，試驗結果見表13、表14。

由表13和表14可以看出，各水平之間差異略顯著。4個因素中，極差(R)值最大的是KT因素，最小的是NAA因素和6-BA因素，4個因素對筇竹叢生芽苗增殖倍數的影響由大到小的順序為KT、培養基、NAA、6-BA。因此，隨著KT質量濃度的逐漸增加，叢生芽的增殖倍數先減后增，當KT質量濃度為1.0 mg·L-1時增殖倍數達到最大，對試驗結果進行方差分析，深入確定試驗因子及其各水平對試驗結果的影響程度(表15)。

表13 叢生芽增值倍數正交試驗結果的直觀分析

表14 叢生芽增值倍數正交試驗結果K值優水平

表15 筇竹叢芽增殖倍數正交試驗結果方差分析

方差分析結果與極差分析結果趨勢一致，6-BA、NAA質量濃度對分化叢芽的增殖影響極顯著。而KT質量濃度對分化叢芽增殖的影響不顯著，說明6-BA和NAA具有很重要的作用。對觀測到的增殖情況和試驗數據進行綜合分析，研究認為，適合筇竹分化叢芽增殖的培養基配方為1/2MS+0.3 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA。

2.4 不同植物生長調節劑組合對再生植株誘導生根的影響

以1/2MS培養基為基礎培養基，將誘導分化出的健康芽叢長成的小植株轉入表6的不同處理的生根培養基中，30 d后記錄統計平均生根率，并對生根率進行直觀分析和方差分析(表16)。

由表16和表17可知，試驗3個因素中R值最大的是NAA因素，最小的是6-BA因素，3個因素對筇竹生根率的影響由大到小的順序為NAA、IBA、6-BA，因此，NAA質量濃度對生根率的影響最大。

表16 植物生長調節劑生根試驗統計

表17 植物生長調節劑生根正交試驗結果K值優水平

誘導叢生芽生根在竹類植物組培快繁中占據重要地位，是其試管快繁成功的關鍵。在誘導生根的過程中，培養基內僅添加一種植物生長調節劑易使叢生芽發生褐化甚至死亡，且生根率不高，植株長勢不良，配合其他細胞分裂素的培養基在褐化、生根率及植株長勢上均有明顯提高，究其原因可能是細胞分裂素抑制了葉綠素的降解，對竹類植物的葉片保持活力，且細胞分裂素對氨基酸等營養物質的運輸有一定作用，進而延緩植物組織的老化。所以在誘導生根的過程中，將植物生長素與細胞分裂素的配合使用顯得尤為重要。從筇竹組培苗長勢、煉苗與移栽后的效果，結合生根率、生根數和根系質量綜合分析，確定出筇竹組培苗最優培養基為1/2MS+0.3 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1IBA。

2.5 不同基質對筇竹組培苗移栽成活率的影響

煉苗移栽30 d，在m(河沙)∶m(腐殖土)=1∶2的基質中成活率為40%，筇竹移栽苗生長緩慢，部分頂端葉片發黃；在m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶2的基質中成活率為60%，筇竹移栽苗長勢良好，葉片深綠色；在m(河沙)∶m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的基質中成活率達到90%，且苗生長健康茂盛，葉片深綠色(表18)。由此可以看出，筇竹移植苗在m(河沙)∶m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的成活率最高，且苗生長狀況最佳，在規模化進行移栽時，應選用m(河沙)∶m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的基質進行移植。

表18 不同基質對筇竹組培苗移栽成活率的影響

3 結論與討論

筇竹外植體單一組織消毒方法的效果較組合消毒試劑浸泡處理后的效果差，不同消毒試劑種類、質量濃度及浸泡時間長短對其萌芽率和成活率具有直接的影響。研究結果表明，單用酒精、次氯酸鈉、甲醛、升汞中的任何一種試劑對筇竹外植體消毒的效果比組合使用消毒效果差，采用體積分數0.5%甲醛(12 h)→體積分數75%酒精(15 min)→體積分數0.1%升汞(8 min)的處理效果最為理想，種胚污染率為3.33%，萌芽率為86.21%，成活率為83.33%。

在不同生長調節劑對筇竹叢芽誘導的影響方面，不同質量濃度的NAA對筇竹的萌芽率、叢芽誘導率的影響均差異不顯著。研究表明，只有當NAA質量濃度為0.2 mg·L-1時的萌芽率、叢芽誘導率最高，即MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的試驗組合筇竹叢芽誘導率最高，達到66.67%。

筇竹叢生芽增殖的影響在不同植物生長調節劑組合的影響下，KT質量濃度是筇竹叢生芽增殖倍數的決定性影響因子，隨著KT質量濃度的逐漸增加，叢生芽的增殖倍數先減后增，當KT質量濃度為1.0 mg·L-1時增殖倍數達到最大。研究表明，6-BA、NAA質量濃度對分化叢芽的增殖影響極顯著，最適合筇竹分化叢芽增殖的培養基配方為1/2MS+0.3 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA。

在利用不同植物生長調節劑對筇竹誘導生根的過程中，培養基內僅添加一種植物生長調節劑易使叢生芽發生褐化甚至死亡，且生根率不高，植株長勢不良，配合其他細胞分裂素的培養基在褐化、生根率及植株長勢上均有明顯提高，研究認為，由于細胞分裂素抑制了葉綠素的降解，同時細胞分裂素促進氨基酸等營養物質的運輸，進而延緩筇竹組織的老化。在筇竹組培苗生長、煉苗與移栽后進行觀察試驗，確定最優培養基為1/2MS+0.3 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1IBA。另外，筇竹移植苗在m(河沙)∶m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶1∶2基質中的成活率最高，且苗生長狀況最佳，可以應用于規模化進行移栽。

由于筇竹離體快繁中種胚需要在無菌的條件下進行組培，生產環境要求較高；不同的消毒組合對筇竹種胚的污染率、萌芽率和成活率有不同程度的影響，本研究設置9種消毒組合方式有一定的局限性，消毒的組合方式有待進一步探究；試驗設計時采用的KT質量濃度跨度不夠明顯，還需進一步設置大梯度KT質量濃度對生根培養基進行篩選。