膠乳增強免疫比濁法測定脂聯(lián)素的性能評價

何敏 朱秀霞 柯杰馳 吳靜標

【摘要】目的 ?對廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司（優(yōu)尼德）的脂聯(lián)素測定試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）的性能進行評價。 ?方法 ?對優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒的空白吸光度、分析靈敏度、線性、準確度和重復性性能進行評價，并用優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒和Mercodia Adiponection ELISA對110例臨床樣本進行相關性分析和Bland-Altman一致性分析。 ?結(jié)果 ?優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒在0μg/mL～40μg/mL范圍內(nèi)的線性關系良好且相關系數(shù)r為0.998 92，準確度水平1和水平2樣本的平均相對偏差分別為7.33%和6.83%，重復性水平1和水平2樣本的變異系數(shù)小于1.62%和1.49%，空白吸光度為0.758 78，分析靈敏度為0.095 9，與Mercodia Adiponection ELISA比對具有良好的相關性。 ?結(jié)論 ?優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒空白吸光度小、分析靈敏度高、準確度高、重復性好，與Mercodia Adiponection ELISA進行比對，一致性良好，符合臨床實驗室要求。

【關鍵字】 脂聯(lián)素;膠乳增強免疫比濁法;性能評價

基金項目：典型免疫和分子診斷計量技術(shù)、儀器研究及產(chǎn)業(yè)公共服務平臺建設（20202004071900008）

脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）是一種主要由脂肪細胞分泌的蛋白類激素，屬于脂肪因子家族的一員，大量存在于血液循環(huán)中，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性及葡萄糖代謝的過程中起到重要作用，是目前發(fā)現(xiàn)的與體脂含量呈負相關的脂類、糖類代謝重要調(diào)控因子。大量流行病學調(diào)查顯示，罹患糖尿病、心血管疾病及相關并發(fā)癥的患者APN水平遠低于健康人群。因此APN在心血管疾病和糖尿病及其綜合征等疾病中具有臨床應用價值，可以為這些疾病的預防和預后提供參考。

檢索國家藥品監(jiān)督管理局國產(chǎn)醫(yī)療器械數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)APN檢測試劑盒擁有有效注冊證的公司僅有9家，方法學包括基于膠乳增強免疫比濁法、化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法，其中膠乳增強免疫比濁法占5家。酶聯(lián)免疫法檢測需人工操作、耗時長，不適合單樣本檢測;化學發(fā)光法的雖然靈敏度高，但是其檢測需要特定的化學發(fā)光儀，成本較高，臨床檢測中應用范圍較小;優(yōu)尼德的脂聯(lián)素測定試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）試劑盒配有所需的所有試劑，包括比濁試劑、校準品和質(zhì)控品，即開即用，不需要額外試劑或提前準備，且適用各種型號的生化分析儀，使用方便。

本研究通過使用廣東優(yōu)尼德生物科技有限公司（以下簡稱優(yōu)尼德）的脂聯(lián)素測定試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）測定臨床血清樣本中的APN水平，考察該試劑盒的試劑空白吸光度、分析靈敏度、線性、準確度和重復性，全面評價優(yōu)尼德脂聯(lián)素試劑盒的性能指標，以期為未來使用脂聯(lián)素試劑盒進行臨床診斷提供指導與性能參考。

1材料和方法

1.1一般資料

參照EP9-A2和《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》，選取2018年1月至2018年12月湖北省新華醫(yī)院檢驗科110例糖尿病患者和普通血糖測試者的臨床樣本，其中男63例，女47例，平均年齡（51.23±16.48）歲。試劑空白吸光度、靈敏度、線性、準確度、重復性試驗所用樣本為企業(yè)參考品。

1.2儀器和試劑

考核系統(tǒng)儀器：全自動生化分析儀（型號：BS380，廠家：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

對照系統(tǒng)儀器：酶標儀（型號：Epoch，廠家：美國BioTek Instruments）。

考核系統(tǒng)試劑：脂聯(lián)素測定試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）（批號：3610020170821，廠家：優(yōu)尼德），APN校準品（批號：380520170822，廠家：優(yōu)尼德），APN質(zhì)控品（批號：370520170822，廠家：優(yōu)尼德）。

對照系統(tǒng)試劑：Mercodia Adiponection ELISA（批號：27565，廠家：瑞典Mercodia AB）。

1.3檢測方法

1.3.1試劑空白吸光度試驗：使用優(yōu)尼德脂聯(lián)素測定試劑盒重復測定蒸餾水3次，并記錄吸光度A2，A2均值除以100 00即為試劑空白吸光度測定值。

1.3.2靈敏度試驗：使用優(yōu)尼德試劑盒檢測10.0μg/mL的脂聯(lián)素蛋白配制而成的樣本，記錄測試過程終點吸光度與起始吸光度的差值△A。

1.3.3線性試驗：線性范圍也是分析范圍，指分析方法能直接測定的待測物濃度或質(zhì)量的范圍。稀釋高濃度血清樣本為從高至低5個梯度的理論濃度（40.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、1.0μg/mL），每個濃度水平檢測3次，求均值。以理論濃度為自變量，以檢測結(jié)果均值為因變量求出線性回歸方程。

1.3.4準確度試驗：根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會（the National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）EP5-A2對準確度評價的要求，每天使用優(yōu)尼德脂聯(lián)素測定試劑盒對水平1樣品、水平2樣品進行測定，計算標準差、變異系數(shù)及相對誤差，以評價試劑的準確性。

1.3.5重復性試驗：使用優(yōu)尼德脂聯(lián)素測定試劑盒分別對兩個濃度水平質(zhì)控品進行測定，每份濃度水平樣品重復測定10次，進行批內(nèi)重復性實驗測定，計算均值、標準差和變異系數(shù)。

1.3.6方法學比對試驗：使用優(yōu)尼德脂聯(lián)素測定試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）和Mercodia Adiponection ELISA試劑盒，分別對湖北省新華醫(yī)院檢驗科的110例臨床標本進行定量分析，作直線回歸方程，計算相關系數(shù)r，進行相關性分析。

2 結(jié)果

2.1 試劑空白吸光度試驗結(jié)果

優(yōu)尼德試劑盒試劑的空白吸光度均值為0.758 78。

2.2靈敏度試驗結(jié)果

優(yōu)尼德試劑盒試劑的吸光度差值為0.095 9。

2.3線性試驗結(jié)果

線性的R2=0.997 8，相關系數(shù)R=0.998 92，見表1和圖1。

2.4準確度試驗結(jié)果

水平1樣本的平均相對偏差為7.33%，水平2樣本的平均相對偏差為6.83%，見表2。

2.5重復性試驗結(jié)果

水平1和水平2的變異系數(shù)分別為1.62%和1.49%，見表3。

2.6 方法學比對分析和Bland-Altam分析

對優(yōu)尼德與Mercodia的檢測結(jié)果作散點圖，得到R2=0.991 3，相關系數(shù) R=0.995 9>0.95，直線回歸方程為Y=1.024 3X-0.086 4，試驗組與對照組檢測結(jié)果均具有良好線性關系。見圖2。

以試驗組與對照組的均值為橫坐標，比值為縱坐標，進行Bland-Altam分析，僅有4/110（3.6%）在95%一致性界限以外，一致性界限為（0.87，1.12），見圖3。

3 討論

脂聯(lián)素是由apM1基因編碼的一種含244個氨基酸的蛋白質(zhì)，由氨基端非螺旋功能區(qū)、N-末端信號肽、膠原樣結(jié)構(gòu)域和C-末端的球狀結(jié)構(gòu)域組成，脂聯(lián)素的球狀結(jié)構(gòu)域與膠原蛋白VIII和X以及補體因子C1q25蛋白質(zhì)同源，能促進脂聯(lián)素與脂聯(lián)素受體的結(jié)合。apM1基因位于人類3q27號染色體上，編碼一種由肝臟脂肪細胞所分泌的內(nèi)源性生物活性蛋白質(zhì)ADPN。ADPN是一種非常重要的心血管保護因子，在調(diào)節(jié)能量代謝（比如糖代謝和肪肪代謝）、炎癥、抗動脈粥樣硬化等起著重要作用，是重要的糖尿病早篩生物標記物。ADPN的N-末端膠原樣結(jié)構(gòu)域通過賴氨酸殘基的羥基化和糖基化形成脂聯(lián)素三聚體復合物，脂聯(lián)素的三聚體通過二硫鍵結(jié)合成六聚體或高分子量脂聯(lián)素多聚體，這些多聚體是循環(huán)脂聯(lián)素的主要形式，也是脂聯(lián)素免疫比濁測定試劑盒的檢測靶標。目前中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院內(nèi)分泌科尤麗麗等人使用優(yōu)尼德的脂聯(lián)素免疫比濁測定試劑盒成功確立了健康人的血漿脂聯(lián)素水平的參考范圍為男性>3 mg/L，女性>3.4 mg/L 。

作為對照組的Mercodia公司長期專注于代謝紊亂領域尤其是糖尿病和肥胖領域的Elisa臨床診斷和科研方面的應用。Mercodia的質(zhì)量體系由QSR管理，并通過了ISO13485的認證，其產(chǎn)品出口世界上100多個國家。Mecodia的檢測試劑盒均使用單克隆抗體（單克隆抗體具有單一的抗原決定簇）和一流的原料，使其試劑盒具有非常高的靈敏度和特異性，可以保證實驗的高度重復性。2009年，Mercodia被評為為全球胰島素檢測的最權(quán)威機構(gòu)之一，是WHO推薦的提供金標準方法和產(chǎn)品的權(quán)威公司。Mercodia的Elisa法脂聯(lián)素檢測試劑盒作為Mercodia胰島素檢測系列產(chǎn)品廣泛被醫(yī)院所使用。

本研究通過對優(yōu)尼德脂聯(lián)素測定試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）的性能指標進行驗證，并與瑞典Mercodia的Adiponection ELISA試劑盒進行方法學比對研究，測定結(jié)果具有極高的一致性。利用Bland-Altman法作為圖形分析法，顯示優(yōu)尼德和Mercodia公司兩種檢測系統(tǒng)對ADPN測量結(jié)果一致性良好，優(yōu)尼德的檢測系統(tǒng)適用于ADPN檢測。優(yōu)尼德的脂聯(lián)素測定試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）在脂聯(lián)素檢測上具有樣本測試速度快、靈敏度高、準確度、重復性結(jié)果良好，試劑穩(wěn)定性強等諸多優(yōu)點，可以為相關疾病的臨床評價提供精確指導。

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