野豬非洲豬瘟監測的規范化采樣管理初探

張 麗，朱向博，晁青鮮，李金邦

（太原動物園，太原030009）

據農業農村部發布的信息統計，2018年8月3日至2020年11月8日，全國共發生非洲豬瘟疫情181起。因非洲豬瘟疫情影響，大量生豬被無害化處理，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。在181起疫情中野豬疫情6起，約占國內總疫情數的3.3%，疫情分別發生于吉林白山市、黑龍江農墾總局、陜西佛坪縣、湖北神農架林區等6地，加上野豬活動區域大（8～12 km2），且游走性強，染疫野豬容易散播疫病，僅有的6起疫情大大增加了非洲豬瘟防控的不確定性，增加了生豬養殖產業健康發展的風險。在有效疫苗成功研制及臨床應用之前，野豬非洲豬瘟疫情監測工作勢必常態化。

科學采樣、規范送檢是實驗室非洲豬瘟檢測結果準確性的必要保證。關于動物疫病監測（或檢測）的采樣，有國家推薦標準或者行業標準[1-5]，以及省（市）的地方標準，但每種疫病的流行病學、病理學特征及防控要點不盡相同。這些標準缺乏某種疫病樣品采集的具體操作細則，參考性相對較低。

2019年至今，太原動物園野生動物疫源疫病監測站受山西省自然保護區管理站疫源疫病監測主管部門的委托，特委派專業的獸醫人員進行野豬非洲豬瘟樣品的采集及送檢。為了確保所采集樣品的科學性，保證后期非洲豬瘟實驗室檢測結果的準確性，結合采樣實踐工作，擬定以下采樣細則及管理規范，以供同業參考。

1 采樣前準備

1.1 采樣物資準備

防護用品：生物防護服、外科醫用口罩或N95口罩、護目鏡、乳膠手套和膠靴等。

解剖器械：解剖刀、磨刀棒和手術刀等。

采樣用品：鑷子、止血鉗、手術剪、生理鹽水或pH 7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS）、10 mL注射器、0.1 mol·L-1EDTA抗凝劑、EDTA真空采血管、2 mL離心管、采樣袋、酒精棉、酒精燈、油性記號筆、無菌采樣袋和鋁盒等。

消毒用品：75%乙醇溶液、84消毒液和生石灰等。

臨時存儲運輸用品：生物冰袋、生物安全運輸箱或者泡沫箱及車載冷凍冰箱等。

1.2 工作準備

科學采集是有效送檢的前提，科學采集的重點是要控制采集的時效性。樣品采集原則上要盡可能早，死亡野豬內臟樣品不應遲于死后6 h[2]。因此應提前準備好采樣的物資，接報有野豬樣品需要采集時，應立即攜帶采樣物資前去。

由于林區或者野外野豬非洲豬瘟樣品采集和送檢的特殊性，24 h內往往完成不了，因此在采樣出發前，需提前預訂送檢用的干冰和專用泡沫包裝箱（一般需提前24 h預定干冰），或者提前聯系專業冷鏈送檢公司下樣品送檢訂單。

1.3 傳染病防控知識準備

采樣的對象是被獵殺或感染未知病原死亡的野豬，是常見的野生動物源人獸共患傳染病疫源。采樣人員有感染豬布魯氏桿菌病、豬鏈球菌病、炭疽、豬流感、森林腦炎等人獸共患傳染病的風險，如果采樣過程中缺乏防范此類傳染病的防控知識，會嚴重威脅相關操作人員的生命安全及環境安全。所以，采樣前相關操作人員一定要了解與野豬相關的重大疫病防感染的防護知識和防止疫病散播的防控知識。

首先，參與采樣的人員，手或體表其他外露部位有外傷的不得參與解剖、采樣、處理尸體或清掃消毒；其次，采樣人員一定要穿防護服、膠靴，佩戴護目鏡、乳膠手套、外科醫用口罩或N95口罩，做好個人防護，免受傳染病侵害；最后，解剖采樣結束后要做好場地的消毒、解剖耗材及尸體的無害化處理，嚴防采樣過程中把病原散播到環境中，以免造成潛在疫病的散播、流行。

2 采樣過程

整個采樣過程主要包括采樣前對采樣對象的初判、解剖取樣、采樣后的信息記錄及無害化處理等工作。

2.1 采樣前初判

不論是被獵殺而死的野豬，還是在環境中正常或非正常死亡的野豬，解剖前均要觀察野豬的整體外觀情況。眼觀野豬尸體的眼睛、鼻腔、口腔、肛門等天然孔是否有出血，如有出血，血的顏色是否為醬油色，是否有血凝不良的現象等，對初判疑似炭疽（天然孔出血，醬油色血，血凝不良）的野豬，嚴禁解剖。并用無菌注射器采集疑似野豬的血液，送當地獸醫實驗室涂片鏡檢。鏡檢炭疽陽性的應就近進行填埋或者焚燒等無害化處理；為炭疽陰性的方可進行解剖采樣。

2.2 解剖取樣

2.2.1 場地處理

剖檢采樣要選擇平坦的地方進行，且鋪上厚塑料布，防止解剖過程中可能攜帶病原的血液、胸腹水等污染物污染解剖場地，防止疾病散播。

2.2.2 蜱蟲采集

野豬非洲豬瘟本底調查需采集野豬窩或者野豬身上的蜱蟲（主要為鈍緣軟蜱），故在剖檢前要用細篩子將豬窩周邊的土層過篩采集泥土中的蜱蟲，或者在野豬的耳后、腋下和腹股溝等軟組織區域尋找蜱蟲。蜱蟲在非洲豬瘟的傳播中充當著重要的傳播媒介，檢測蜱蟲的帶毒情況，是野豬非洲豬瘟監測的重要一環。一般情況下，盡可能多地采集蜱蟲，放至2 mL離心管中。

2.2.3 剖檢體位準備

首先將野豬尸體呈仰臥位放置，然后分別從野豬兩側腋下處縱切至肩關節處下壓，使兩前肢向外平伸，沿腹股溝縱切至髖關節處下壓，使兩后肢向外平伸，以便于解剖采樣。

2.2.4 血液采集

如果是活捉的野豬仔豬，可以頸靜脈采血或者心臟采血。如果是被獵槍擊斃的野豬，心臟可能沒有未凝固的血液，在縱切前后肢過程中流出血液時，應及時使用提前用EDTA標準液濕潤過的一次性無菌注射器采集血液，每份血液1～3 mL，輕搖混勻后輕輕打入EDTA真空采血管中。

2.2.5淋巴結采集

非洲豬瘟檢測一般采集頜下淋巴結、腹股溝淋巴結或腸系膜淋巴結，其中腹股溝淋巴結最不易受到解剖污血、污物的污染，所以一般采集腹股溝淋巴結。腹股溝淋巴結在腹股溝皮下，常有脂肪層包裹，腹股溝左右各一個，采集時需觀察淋巴結是否有水腫或者切面有無炎性癥狀，是否有出血等。淋巴結作為機體免疫器官，如為感染性疾病造成野豬死亡的，淋巴結或多或少會有腫大及出血的情況。

2.2.6 扁桃體采集

仔豬扁桃體可以直接用刀沿口裂切開，上下頜分開在舌根及會厭部，用滅菌的手術剪和鑷子（或止血鉗）采集扁桃體。亞成體及成年的野豬，采集扁桃體時，需用解剖刀先去除下巴至頸部的皮，再沿下巴下頜骨內沿切開頜下肌肉至頸部，切口呈V字形，在下巴處向外拉下巴肌肉，暴露出舌頭，再把舌頭拉向頸部，切開豬舌兩側的肌肉，直至暴露扁桃體。被血液或者野豬口腔中的污物所污染的扁桃體，采集后需要用生理鹽水或者0.01 mol·L-1、pH 7.4的PBS液沖洗，然后放入病料袋中。

2.2.7 開腹采樣

野豬扒皮后，先用手術刀切開腹部肌肉層，再用手或者鈍性器械（如鑷子的鈍端）打開腹膜層，打開腹膜禁用尖銳器械，尖銳器械容易刺破腸道，造成腸內容物涌出污染腹腔臟器。開腹后首先采集肝臟，如果肝臟眼觀有病變，則采集病變區的樣品；其次采集脾臟；最后采集腎臟。非洲豬瘟陽性的豬，脾臟一般會腫大到原來的2～3倍，而陽性野豬的脾臟情況暫時未見報道。但是作為免疫器官，如果感染非洲豬瘟，野豬脾臟異常腫大的可能性非常大。

2.2.8 開胸采樣

用解剖刀沿胸骨與肋骨的軟骨結合處將兩者分離，然后切開橫膈膜即可暴露胸腔。首先觀察胸腔內是否有積液或出血，其次觀察心包的情況，然后再觀察肺臟的外觀及按壓情況。最后無菌采集肺臟，并觀察肺臟的切面是否有炎性滲出物及瘀血等。

注意事項：樣品采集前后及過程中均需拍照記錄組織臟器的解剖特征，每采集一種組織臟器，需更換手術剪、鑷子等采樣器械或者用乙醇擦拭灼燒，以確保各組織臟器樣品不交叉污染。實質性組織器官的采樣大小一般1～2 cm2（或10～15 g組織樣）即可。采集胸腹腔內的臟器時，臟器有時可能被腸內容物、胸腹水、血液等污染，采集的樣品應大一些，需2～3 cm2（或者20～30 g組織樣），有污物的組織樣需用生理鹽水或者PBS液稍作沖洗后再放進采樣袋中。

2.3 采樣后處理

采樣完成后，首先要及時填寫詳細的送樣信息表。信息表要如實填寫，跟樣品一起送檢。野豬送樣信息表內容應包括：采樣負責人及聯系方式、采樣日期及時間、采樣地點、野豬死亡時間、野豬性別、野豬估重、野豬大概年齡、所采樣品類型（肝臟、脾臟、肺臟、蜱蟲等）、每種樣品數量等。另外應簡單備注上野豬的病理解剖描述，如脾臟有無腫大和異常，肺臟表面出血及剖面瘀血情況，腸系膜及腸道表面有無出血等。

其次，將野豬尸體及采樣相關的廢棄物無害化處理。野豬可以深坑填埋，填埋坑要求遠離居民區、養殖區和水源，坑深要求放進野豬尸體后距離地面至少1 m深（保證尸體不被其他動物刨出來），填埋坑底層撒上2～5 cm厚的生石灰，放進野豬尸體后，身體上撒上2～5 cm厚的生石灰，再將尸體坑填土夯實，最后在夯實的坑表面撒上約1 cm厚的生石灰。也可連帶解剖用的塑料墊布、防護服、乳膠手套等可燃廢棄物一起焚燒處理。如有血液、腹水等污染物從塑料墊布浸透到地面的，用1 000 mg·L-1有效氯的84消毒液或2%～5%的火堿溶液對污染場地潑灑浸泡至少60 min，對野豬運輸工具進行2～3遍的噴灑消毒。采樣工具用酒精棉擦拭并用醫用乙醇浸泡消毒至少10 min。

3 樣品送檢

從樣品采集到送至檢測機構，24 h內能完成的，全程可用添加5～6個500 mL的冷凍冰袋或冰磚的儲存容量為5～10 L的生物安全運輸箱或密封泡沫箱4℃冷藏送檢；超過24 h的，樣品需-20℃以下低溫暫時凍存并運輸至實驗室-60℃超低溫冷凍保存。送檢運輸途中需全程冷鏈凍存運輸，一般采用“生物安全運輸箱+干冰或者泡沫箱+干冰”包裝運輸。干冰的用量需根據運輸時間和干冰的消耗量來計算，常規狀態下，條塊狀干冰在4 cm厚的密封泡沫箱內或生物安全箱內每天損耗2～2.5 kg。樣品應交由專業的冷鏈公司送貨，或由專業的獸醫人員送檢，嚴防在送貨途中將可能存在的病原（如非洲豬瘟病毒、豬流感病毒、豬布魯氏桿菌等）散播到環境中。

4 小 結

在野豬非洲豬瘟本底調查采樣中，采集對象可能是被獵殺的健康狀況未知的野豬，或者是病死的野豬（如陜西佛坪、湖北神農架）。考慮采樣過程中操作人員有感染人獸共患病的風險，要求參與采樣操作的人員必須嚴格做好防護，從頭到腳，穿戴護目鏡、口罩、防護服、乳膠手套和膠靴。且采樣耗材及尸體的無害化處理過程必須由獸醫人員監督執行，嚴防操作不當造成人員感染和病原外泄散播。

每頭野豬的每種樣品必須至少采集3份：一份送至國家林草局野生動物疫病研究中心，一份送至省級動物疫病預防控制中心，一份留作復檢備檢樣品（-60℃以下超低溫凍存）。每個樣品袋上必須標記清楚野豬的性別、大概年齡、組織臟器名稱、采樣時間地點及樣品編號等，并詳細填寫加蓋有采樣單位公章的采樣送檢單。若剖檢時發現內臟器官異常的，送檢時最好附上圖文并茂的解剖描述說明。