酶法檢測肌酐水平降低的秘密：羥苯磺酸鈣的干擾

陳克娜 綜述，諶海蘭 審校

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400016

肌酐是一種相對分子質(zhì)量較低的含氮化合物，是肌肉組織中肌酸的代謝終產(chǎn)物，它主要從腎小球?yàn)V過，不被腎小管重吸收，可作為評估腎小球?yàn)V過率和腎功能的重要指標(biāo)[1-2]。目前，臨床應(yīng)用較多的檢測肌酐的方法是苦味酸法和酶法。現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用酶法檢測肌酐的有70.4%，苦味酸法檢測肌酐的有29.6%[3]。然而，臨床上常出現(xiàn)肌酐檢測結(jié)果和患者臨床表現(xiàn)不符的情況。這與實(shí)驗(yàn)室所用方法，儀器的特異度和抗干擾能力不同有關(guān)，也與多種物質(zhì)的干擾有關(guān)，特別是藥物的干擾，且不同藥物的干擾方向不盡相同[4]。

羥苯磺酸鈣是一種血管保護(hù)劑。它通過降低毛細(xì)血管通透性、血液黏度和血小板高活性來改善異常的血液流變學(xué)和微循環(huán)，在治療糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、慢性靜脈功能不全和各種微血管病變中發(fā)揮著重要作用[5]。研究表明羥苯磺酸鈣對慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎損傷也有治療作用[6]。但是，這一臨床常用藥物會(huì)對酶法檢測肌酐產(chǎn)生負(fù)干擾[6]，其干擾產(chǎn)生機(jī)制尚不明確。探究其干擾機(jī)制、尋求消除或減輕干擾的方法是一線工作者的重任。

1 臨床常用的肌酐檢測方法

目前，應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室的肌酐檢測方法已達(dá)10余種。其中，同位素稀釋質(zhì)譜法是血清肌酐檢測的決定性方法[7]，同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是我國肌酐檢測的參考方法[8]。由于每種方法的抗干擾能力不同，又受到檢測成本和通量的限制，目前臨床應(yīng)用較多的是苦味酸法和酶法。部分肌酐檢測方法的比較見表1。

表1 不同肌酐檢測方法的比較

1.1堿性苦味酸法 堿性苦味酸法是最經(jīng)典的肌酐檢測化學(xué)方法。其原理是肌酐在堿性條件下與苦味酸反應(yīng)生成橘紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物，通過比色法在505～520 nm波長處檢測樣品肌酐水平[8]。這種方法最早為臨床所用，但其抗干擾能力差，易受到多種非特異性色原的干擾，如膽紅素、抗壞血酸、α-酮酸、丙酮、乙酰乙酸、葡萄糖、蛋白質(zhì)、胍、胍乙酸內(nèi)酰胺等。盡管實(shí)驗(yàn)室對苦味酸法進(jìn)行了一些改進(jìn)，比如使用新鮮配制的試劑、給試劑倉加防護(hù)罩減少試劑與空氣接觸、按時(shí)定標(biāo)保證試劑有效性、采用時(shí)差法檢測肌酐、吸附法去除干擾物等，仍然不能完全解決非特異性色原干擾的問題。

1.2肌氨酸氧化酶法 肌氨酸氧化酶法是酶法中的一種。肌氨酸氧化酶法根據(jù)原理不同還包括肌酐酰胺水解酶法和亞胺水解酶法[3]。肌氨酸氧化酶法是國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室使用最多的肌酐檢測方法[9]，其檢測原理是肌酐在肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶的作用下逐步水解得到H2O2，生成的H2O2通過偶聯(lián)終點(diǎn)比色法反應(yīng)生成有色物質(zhì)，檢測肌酐水平[10]。

酶法應(yīng)用時(shí)間較晚，優(yōu)勢顯著，但也受到部分干擾物的影響，例如：5-氟胞嘧啶、酚磺乙胺、多巴胺、多巴酚丁胺、硝基甲烷、抗壞血酸、羥苯磺酸鈣等。其中，多巴胺、多巴酚丁胺能可逆地黏附于留置導(dǎo)管，使靜脈穿刺和留置導(dǎo)管標(biāo)本的肌酐檢測結(jié)果差異較大；而腎上腺素和去甲腎上腺素則不會(huì)黏附于留置導(dǎo)管，兩種類型標(biāo)本檢測結(jié)果差異小于5%[11]。另外，免疫球蛋白M會(huì)對酶法檢測肌酐產(chǎn)生正干擾，這種干擾可以通過超濾法消除[12]。苦味酸法和酶法的幾種常見干擾物及其干擾方向見表2。

表2 幾種常見物質(zhì)對肌酐檢測的干擾

研究顯示苦味酸法和酶法兩者檢測結(jié)果有良好的相關(guān)性(r=0.998，P<0.001)，但通過回歸分析其斜率和截距發(fā)現(xiàn)兩者的檢測結(jié)果不能互換，且當(dāng)肌酐水平低于180 μmol/L時(shí)，與酶法比較，苦味酸法的最大正偏倚為14.1%[10]。在實(shí)際應(yīng)用方面，苦味酸法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、平均回收率、抗干擾能力均比酶法低，并且由于線性范圍略小而無法準(zhǔn)確檢測高出一定水平范圍的肌酐[1]，因此，酶法被越來越多的臨床實(shí)驗(yàn)室采用。

2 羥苯磺酸鈣對肌酐檢測的干擾

2.1羥苯磺酸鈣的藥代動(dòng)力學(xué) 含有羥苯磺酸鈣的商品有多貝斯、昊暢、安多明、導(dǎo)升明等。羥苯磺酸鈣多為口服，用法一般為500 mg/次，2～3次/日。該藥主要以原形通過腎臟、腸道排泄，僅有10%以代謝產(chǎn)物排泄。口服給藥后24 h內(nèi)大約各有50%從尿液和糞便中排泄[18]。健康人群單次口服500 mg羥苯磺酸鈣后，3～6 h血藥水平可達(dá)峰值，其濃度約為8～15 μg/mL；靜脈給藥500 mg后，5 min血藥水平可達(dá)峰值，濃度為65 μg/mL[19]。羥苯磺酸鈣血漿半衰期在5 h左右[20]，在人體內(nèi)可達(dá)到的谷濃度和峰濃度范圍分別是2.66～8.33 μg/mL和12.83～23.15 μg/mL[21]。服用羥苯磺酸鈣后的穩(wěn)態(tài)濃度平均為6.64 μg/mL[6]，服用后血藥濃度半衰期為穩(wěn)態(tài)濃度的95%左右[9]。

2.2羥苯磺酸鈣的作用機(jī)制 已有研究證實(shí)羥苯磺酸鈣在治療糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變中的療效和安全性較好[22]。在ZHOU等[23]的研究中，羥苯磺酸鈣可降低糖尿病腎病患者的內(nèi)皮功能障礙標(biāo)志物水平，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、內(nèi)皮素-1，同時(shí)炎癥標(biāo)志物例如正五聚體蛋白3(PTX3)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、超敏C-反應(yīng)蛋白、細(xì)胞間黏附分子的水平也降低，但一氧化氮(NO)水平升高，且腎小球?yàn)V過率沒有變化。通過回歸分析發(fā)現(xiàn)PTX3、NO和糖化血紅蛋白是糖尿病腎病的影響因素。NJAU等[24]研究發(fā)現(xiàn)羥苯磺酸鈣可抑制VEGF165誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性、遷移、增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR-2)的磷酸化，并且可抑制VEGFR-2介導(dǎo)的信號級聯(lián)活性。此外，在VEGF滿足生理水平以維持腎小球完整性的情況下，羥苯磺酸鈣可降低糖尿病小鼠腎臟的VEGF信號，改善糖尿病腎病和周圍神經(jīng)病變。上述研究結(jié)果提示羥苯磺酸鈣是VEGF的抑制劑，沒有完全阻斷VEGF的負(fù)面影響，可作為治療糖尿病腎病的有效藥物。在ZHANG等[25]的研究中，羥苯磺酸鈣通過降低患者纖溶酶原激活物抑制劑-1和纖維蛋白原的水平降低尿激酶和組織型纖溶酶原激活物的活性，從而激活纖溶酶原并減輕腎小球硬化的程度。

2.3羥苯磺酸鈣對肌酐檢測的負(fù)干擾 羥苯磺酸鈣應(yīng)用廣、市場價(jià)格低，是一種長效使用藥物，但體內(nèi)和體外研究均證實(shí)羥苯磺酸鈣會(huì)對酶法檢測肌酐產(chǎn)生負(fù)干擾，并且短期內(nèi)服用沒有明顯的腎臟保護(hù)作用，還會(huì)通過負(fù)干擾影響腎功能的正確評估[26]。

羥苯磺酸鈣對酶法的干擾程度與干擾物及肌酐基礎(chǔ)水平相關(guān)。當(dāng)外源添加的羥苯磺酸鈣濃度達(dá)到4 μg/mL時(shí)，與未添加羥苯磺酸鈣的肌酐檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[19]，當(dāng)外源添加的羥苯磺酸鈣水平達(dá)到8 μg/mL時(shí)，即可使8種酶法肌酐檢測系統(tǒng)的結(jié)果下降4.4%～36.3%[6]，且羥苯磺酸鈣水平越高，負(fù)干擾越嚴(yán)重。在GUO等[6]的研究中，低水平肌酐受羥苯磺酸鈣的干擾最大，其次是中水平、高水平。并且受試者口服500 mg羥苯磺酸鈣后的血藥水平與肌酐濃度曲線趨勢相反，但在此過程中胱抑素C水平?jīng)]有明顯變化，這暗示羥苯磺酸鈣與肌酐檢測結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。羥苯磺酸鈣除了對肌酐檢測產(chǎn)生負(fù)干擾，也會(huì)對尿酸、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、糖化清蛋白等產(chǎn)生一定負(fù)干擾[27]，且對尿酸、三酰甘油的負(fù)干擾較為明顯[21]。

羥苯磺酸鈣引起的負(fù)干擾對腎功能不全患者可能會(huì)產(chǎn)生更嚴(yán)重的影響。對于腎功能不全患者，羥苯磺酸鈣對酶法檢測的負(fù)干擾導(dǎo)致結(jié)果假性降低，使患者誤認(rèn)為該藥物有明顯的改善腎功能的作用，可能出現(xiàn)錯(cuò)誤的藥物減量或停藥。并且腎功能不全患者腎小球?yàn)V過率低，藥物容易堆積，干擾可能更嚴(yán)重。余久如等[28]的研究也證實(shí)了這一說法，特別是當(dāng)估算腎小球?yàn)V過率低于12 mL/(min·1.73 m2)時(shí)，穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣水平急劇升高。對于腎小球?yàn)V過率正常的患者，服藥24 h血藥水平均在6 μg/mL以上，所以無論何時(shí)采集血液標(biāo)本都極有可能對酶法檢測肌酐產(chǎn)生負(fù)干擾[9]。

慢性腎臟病(CKD)分期直接依賴于腎小球?yàn)V過率[29]，其結(jié)果的差異將影響腎小球?yàn)V過率在判斷和估計(jì)CKD進(jìn)展中的應(yīng)用[30]。宋亞男等[26]對服用羥苯磺酸鈣合并CKD的患者進(jìn)行了CKD分組研究，CKDⅠ～Ⅱ期患者的肌酐檢測及腎功能評估受到羥苯磺酸鈣的影響小，但CKDⅢ～Ⅴ期肌酐檢測及腎功能評估受到明顯的負(fù)性影響，尤其對CKDⅤ期的患者影響更為明顯。

2.4負(fù)干擾產(chǎn)生機(jī)制的假說 羥苯磺酸鈣對酶法檢測肌酐的負(fù)干擾早有報(bào)道[6]，但產(chǎn)生負(fù)干擾的機(jī)制尚不明確。有學(xué)者提出了以下3種假說[6]：(1)酶法檢測肌酐是基于肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶降解肌酐及其反應(yīng)產(chǎn)物，然后通過偶聯(lián)終點(diǎn)比色法反應(yīng)檢測肌氨酸氧化產(chǎn)生的H2O2，而羥苯磺酸鈣的基本結(jié)構(gòu)是對苯二酚環(huán)，它具有還原性，可能會(huì)消耗H2O2，從而產(chǎn)生負(fù)干擾。(2)羥苯磺酸鈣可能與偶聯(lián)終點(diǎn)比色法反應(yīng)中的其他成分發(fā)生反應(yīng)，從而減少生色基團(tuán)的形成，使檢測結(jié)果假性降低。(3)羥苯磺酸鈣可能會(huì)影響生色基團(tuán)的穩(wěn)定性。第1種假說是被較多學(xué)者認(rèn)可的假說，也是目前試劑廠商等解決干擾問題的出發(fā)點(diǎn)。明確羥苯磺酸鈣對肌酐檢測產(chǎn)生負(fù)干擾的確切機(jī)制將有利于選擇正確的檢測方法從而消除或減小誤差。

3 討 論

肌酐是評估腎小球?yàn)V過率和腎功能的重要指標(biāo)之一，最小化血清肌酐的總允許誤差水平是臨床醫(yī)生準(zhǔn)確診斷急性腎損傷等腎臟病變的必要條件[31]。鑒于肌酐檢測會(huì)受到多種物質(zhì)的干擾，建議醫(yī)師送檢血樣時(shí)說明患者所用藥物的名稱或囑患者停用一些對檢測有干擾的藥物(如羥苯磺酸鈣)一段時(shí)間后再檢測。且對于服用羥苯磺酸鈣的肌酐檢測結(jié)果在進(jìn)行臨床評價(jià)時(shí)加以高度警惕，結(jié)合患者臨床癥狀判斷。如果同期尿素、胱抑素C等檢測結(jié)果沒有明顯降低，可選用其他檢測原理的方法進(jìn)行復(fù)核，也可用酶法和干片法同時(shí)檢測肌酐，進(jìn)行結(jié)果比較。肌酐檢測標(biāo)本盡量避免使用留置導(dǎo)管血[17]，且不宜采用全血標(biāo)本及溶血標(biāo)本[1]，因?yàn)榧t細(xì)胞中的假肌酐較多。對于腎功能不全患者，藥物蓄積引起的負(fù)干擾可能更嚴(yán)重，因此該類患者的肌酐檢測結(jié)果和藥物減量應(yīng)引起臨床足夠的重視[9]。

對于肌酐的檢測有多種方法，檢測原理、試劑盒、檢測系統(tǒng)的差異對肌酐檢測結(jié)果的影響不容忽視，例如目前臨床應(yīng)用較多的酶法與堿性苦味酸法之間存在系統(tǒng)誤差，因此各臨床實(shí)驗(yàn)室要對所用方法進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)，以明確其性能特點(diǎn)及檢測局限性[15]。在抗干擾方面，不管是采用酶法還是苦味酸法，干擾物對不同檢測系統(tǒng)的干擾程度和方向都可能存在差異，但總體而言干擾物對苦味酸法產(chǎn)生干擾的概率高于酶法[14]。并且在酶法基礎(chǔ)上建立的參考方法可以有效完成血清肌酐的檢測，此方法與袁鵬飛等[32]驗(yàn)證檢測的結(jié)果一致，有利于為血清肌酐常規(guī)檢測系統(tǒng)的方法或物質(zhì)溯源提供有效途徑，因此酶法代替苦味酸法檢測肌酐的優(yōu)勢顯而易見。