黃連素抑制心肌細(xì)胞凋亡改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

陳 強(qiáng)，姜 益，郝軍軍，趙 碩

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.心血管外科；2.外科重癥加護(hù)病房，陜西西安 710061

急性心肌梗死是嚴(yán)重的致死、致殘性疾病[1]，由于現(xiàn)代人生活方式的改變，急性心肌梗死的發(fā)病年齡趨于年輕化[2]，目前臨床中治療急性心肌梗死最主要的手段仍然是及時(shí)進(jìn)行缺血部位再灌注，恢復(fù)缺血部位的血流供應(yīng)[3]。但是隨著及時(shí)血液的再灌注的發(fā)展，再灌注損傷的概率逐年增加[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)在再灌注過程中可能進(jìn)一步增加心肌梗死面積，降低心臟收縮功能，引起心臟超微結(jié)構(gòu)改變，甚至誘發(fā)嚴(yán)重的心律失常，最終導(dǎo)致患者死亡[7-9]。

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生過程較為復(fù)雜，其涉及多種致病機(jī)制，目前研究較多的是氧化應(yīng)激、鈣超載、心肌細(xì)胞凋亡及心肌細(xì)胞能量代謝紊亂等[10-11]，缺血再灌注損傷是多種致病機(jī)制交叉的作用結(jié)果。

黃連素是傳統(tǒng)中藥黃連的主要提取物質(zhì)，主要用于治療腹瀉、痢疾及其他胃腸道疾病。黃連具有抗心律失常、降血脂、降血壓等藥理學(xué)活性。

鑒于以上原因，本研究構(gòu)建大鼠體內(nèi)急性心肌缺血再灌注模型，探討急性心肌缺血再灌注損傷中心肌細(xì)胞的凋亡水平，以及黃連素在大鼠急性心肌缺血再灌注損傷中保護(hù)心肌細(xì)胞的機(jī)制，為黃連素在急性心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心購買健康SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量220～240 g，許可證號：SCXK(陜)2018-001，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫25 ℃，晝夜交替各12 h，大鼠可自由飲水和攝食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)，將所有大鼠隨機(jī)分為對照組、假手術(shù)組、模型組和黃連素給藥組(100 mg/kg)，每組15只。動物手術(shù)前預(yù)防給藥14 d，黃連素組灌胃100 mg/kg的黃連素藥物，其余3組灌胃相應(yīng)體積的藥物溶劑，每天定時(shí)灌胃1次。給藥兩周后進(jìn)行大鼠心肌缺血再灌注造模。

1.2大鼠急性心肌缺血再灌注模型的構(gòu)建 大鼠急性心肌缺血再灌注模型的構(gòu)建參照王世玉等[12]的造模方式，模型組及黃連素給藥組大鼠在造模前采用4%的水合氯醛水溶液(10 μL/g)腹腔注射麻醉，待大鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后將其固定于保溫手術(shù)臺上。腹部朝上，剔除頸部、腹部及四肢處所有毛發(fā)，經(jīng)氣管插管，連接于小動物人工呼吸機(jī)(呼吸比為1∶2，呼吸頻率為75次/分)。剪開心包膜，在左心耳下端找出左冠狀動脈前降支，將結(jié)扎細(xì)線從下穿過，收緊細(xì)線，缺血操作30 min后松開細(xì)線，繼續(xù)灌注120 min，完成動物造模后用預(yù)先裝有抗凝劑肝素鈉的小型離心管收集眼眶血2 mL，以備后用，同時(shí)拖頸處死大鼠后收集心肌組織進(jìn)行后續(xù)研究。假手術(shù)組動物經(jīng)歷上述相似操作，不收緊細(xì)線，不造成動物心肌急性缺血。其余操作相同，對照組大鼠只麻醉，其余操作相同。

1.3指標(biāo)檢測

1.3.1計(jì)算心肌梗死面積 每組隨機(jī)取5只大鼠心肌組織，取出冷凍的心肌組織，在解凍之前將其切成厚度為1～2 mm的薄片，將薄片浸泡在1%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37 ℃避光染色30 min，染色結(jié)束后用蒸餾水漂洗3 min，吸干殘余水分后在4%的多聚甲醛中浸泡固定48 h，取出后用相機(jī)拍照，采用Image J軟件分析染色后的心肌組織，紅色或者粉紅色即為正常組織，白色或灰白色為梗死組織，計(jì)算心肌梗死面積百分比(梗死面積百分比=梗死心肌面積/總心肌面積×100%)。

1.3.2測定相關(guān)指標(biāo)水平 每組隨機(jī)取5只大鼠的左心室相同部位，加入9倍體積的生理鹽水制備10%的組織勻漿液，于4 ℃ 6 000 r/min離心10 min后取上清液，測定上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)及丙二醛(MDA)水平。

1.3.3檢測大鼠凋亡狀態(tài) 使用傳統(tǒng)Trizol法提取大鼠心肌組織RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法檢測與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)的表達(dá)水平。使用蛋白裂解液提取大鼠心肌組織細(xì)胞蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)水平，測定心肌組織細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1TTC染色梗死面積比較 通過計(jì)算各組心肌梗死面積百分比，結(jié)果顯示使用黃連素預(yù)防給藥組[(43.29±5.58)%]大鼠心肌梗死面積低于模型組[(25.39±4.26)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2大鼠心肌組織SOD、LDH及MDA水平測定 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組SOD水平降低，LDH、MDA水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃連素給藥組SOD水平上升，LDH、MDA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.3大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因檢測 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組Bax、Caspase-3、Bax/Bcl-2基因相對表達(dá)水平上升，Bcl-2基因相對表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃連素給藥組Bax、Caspase-3、Bax/Bcl-2基因相對表達(dá)水平降低，Bcl-2基因相對表達(dá)水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白檢測 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平上升，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃連素給藥組Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為SOD水平；B為LDH水平；C為MDA水平。

注：A為Bax基因相對表達(dá)水平；B為Bcl-2基因相對表達(dá)水平；C為Bax/Bcl-2基因相對表達(dá)水平；D為Caspase-3基因相對表達(dá)水平。

圖3 大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討 論

急性心肌缺血的發(fā)病逐漸年輕化，同時(shí)急性心肌缺血的病死率居高不下，是臨床中亟待解決的一類致死、致殘率極高的心臟疾病[2]，目前治療策略主要是及時(shí)通過多種途徑恢復(fù)心肌缺血部位的血液供應(yīng)[13]，但有研究表明在心肌缺血后及時(shí)灌注新鮮血液常常引起多種心臟疾病，加劇患者病情，主要有嚴(yán)重的心律失常、心臟收縮功能降低，以及對應(yīng)心臟超微結(jié)構(gòu)的功能性改變[9]。目前急性心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制主要有氧化應(yīng)激、鈣超載、心肌細(xì)胞凋亡及心肌細(xì)胞能量代謝紊亂等[10-11]，急性心肌缺血再灌注損傷可能是多種致病機(jī)制相互交叉作用的結(jié)果。目前對于急性心肌缺血再灌注損傷的治療主要是試圖減少心肌梗死面積及降低急性心肌缺血再灌注損傷中的過氧化水平[14]。

黃連素是傳統(tǒng)中藥黃連的主要提取物質(zhì)，主要用于治療胃腸道類疾病，在降血脂、降血壓及抗心律失常中有良好的治療效果。結(jié)合上述原因，本研究選擇使用黃連素探討其在大鼠急性心肌缺血再灌注損傷中的預(yù)防性治療效果及其作用機(jī)制。

本研究首先采用結(jié)扎的手術(shù)方法，阻斷左冠狀動脈前降支30 min后恢復(fù)血流120 min、人工模擬急性心肌缺血再灌注損傷。結(jié)果顯示，與模型組比較，在預(yù)防性給黃連素后，能夠有效地降低缺血后的心肌梗死面積，同時(shí)在黃連素給藥組中大鼠的心肌組織中LDH水平降低，這與張宏考等[15]的研究結(jié)果相似，提示黃連素能夠有效地保護(hù)心肌梗死。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌組織中SOD的水平降低，這提示心肌組織中存在著大量的氧自由基亟待清除，同時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌中MDA的水平上升，提示存在著心肌組織脂質(zhì)過氧化。已有研究表明，過多的活性氧能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡[16]，結(jié)合本研究可以發(fā)現(xiàn)在急性心肌缺血再灌注中存在心肌細(xì)胞的凋亡，主要表現(xiàn)為抗凋亡蛋白Bcl-2的基因及蛋白表達(dá)水平在急性心肌缺血再灌注損傷模型中降低，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax的基因及蛋白表達(dá)水平上升，黃連素能夠有效地調(diào)節(jié)Bax與Bcl-2的蛋白及基因表達(dá)水平的平衡，與此同時(shí)模型中存在著Caspase-3蛋白的高表達(dá)，這進(jìn)一步提示在急性心肌缺血再灌注損傷中存在著Caspase依賴性心肌細(xì)胞凋亡，這與張煜等[17]的研究結(jié)果相符。

綜上所述，黃連素可通過降低心肌過氧化進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡改善大鼠急性心肌缺血再灌注損傷。