膜聯蛋白A2在神經膠質瘤中的表達及調控表型關鍵基因的生物信息學分析*

謝守嬪，顏偉姍，王 瑛，周迎霞，彭小蘭，李海龍

甘肅省蘭州市第一人民醫院：1.神經科；2.感染管理科，甘肅蘭州 730050；3.蘭州大學第二醫院放射影像科，甘肅蘭州 730030；4.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅蘭州 730000

膜聯蛋白A2(ANXA2)是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，在脊椎動物細胞中廣泛表達。有研究表明，ANXA2在人神經膠質瘤等多種腫瘤細胞中異常高表達，且其表達與預后不良有關，是膠質瘤獨立預后指標[1-4]。據報道，沉默ANXA2可抑制膠質瘤細胞株U251和U87的增殖，相反，上調ANXA2的表達可以促進U251細胞增殖[4]。沉默ANXA2可抑制信號傳導與轉錄激活因子3和細胞周期蛋白D1的表達，將細胞周期阻滯在G1～S期[5]。研究表明，ANXA2參與惡性膠質瘤的血管生成、侵襲和轉移[6-7]。ANXA2的泛素化和降解，S100鈣結合蛋白A11(S100A11)與ANXA2相互作用，參與調節核因子κB(NF-κB)信號通路。此外，NF-κB在轉錄水平上正向調節S100A11，證明了S100A11在神經膠質瘤生長中的作用。為進一步明確ANXA2在神經膠質瘤中的表達及參與膠質瘤惡性表型形成的機制，本研究擬借助于生物信息學軟件，分析ANXA2在神經膠質瘤中的表達、預后及其相關信號通路的分子機制。

1 資料與方法

1.1ANXA2基因在人膠質瘤及癌旁組織中的表達分析 選擇基于癌癥基因組圖譜數據庫的生物信息學分析軟件開展ANXA2在膠質瘤及癌旁組織的表達分析，這些在線軟件包括：UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，ONCOMINE(https://www.oncomine.org/resource/login.html)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)。

1.2ANXA2基因在人膠質瘤組織異常表達的生存分析 利用在線分析網站Human protein atlas(https://www.proteinatlas.org/)對ANXA2基因分別在高表達和低表達膠質瘤患者中的臨床樣本進行無病生存期和總生存期分析。

1.3與ANXA2基因有相關性的基因信號通路富集分析 使用UALCAN軟件檢索與ANXA2基因有相關性的基因，其中表達上調的相關基因的相關系數(r)在0.30～0.99，表達下調的相關基因的r在-0.61～-0.30，并分別將上調和下調的基因全部輸入DAVID 6.8軟件(https://david.ncifcrf.gov/)進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析。

1.4與ANXA2有相關性的腫瘤基因蛋白互作(PPI)網絡分析 選擇在線STRING (https://string-db.org/)數據庫，將34個與ANXA2有相關性的腫瘤基因輸入在線軟件STRING進行PPI網絡分析。并觀察節點，尋找節點最多的關鍵基因。

1.5與腫瘤有相關性的通路基因的表達情況及生存期分析 分析1.3中相關基因富集的信號通路，選擇與腫瘤有相關性的信號通路，以及關鍵基因，利用GEPIA在線軟件分析這些關鍵基因的表達對生存期的影響。

1.6統計學處理 富集分析結果的差異比較采用Fisher檢驗；PPI網絡分析采用K-means聚類算法，以n=3進行聚類分析；生存分析方法采用Log-rank檢驗，檢驗水準α=0.05。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1ANXA2基因在人膠質瘤及癌旁組織中的表達 檢索3個生物信息學分析軟件UALCAN、GEPIA和ONCOMINE的結果表明，與癌旁組織比較，ANXA2基因在人膠質瘤組織中表達上調(P<0.05)，見圖1。

注：A為UALCAN生物信息學分析軟件基因相對表達水平；B為GEPIA生物信息學分析軟件基因相對表達水平；C為ONCOMINE生物信息學分析軟件作者SUN提供的mRNA相對表達水平；D為ONCOMINE生物信息學分析軟件作者SHAI提供的mRNA相對表達水平。

2.2ANXA2基因在人膠質瘤及癌旁組織中的生存分析 采用Human protein atlas分析預后生存期顯示，與ANXA2基因低表達組比較，膠質瘤中ANXA2基因高表達組生存期縮短，預后相對較差(P<0.05)。見圖2。

2.3與ANXA2基因有相關性的基因的信號通路富集分析 通過UALCAN和DAVID 6.8軟件分析發現，與ANXA2基因有相關性的上調基因共有1 396個，富集在35個信號通路中，其中與腫瘤有相關性的有10個，分別是Wnt信號通路、結直腸癌、cAMP信號通路、AMPK信號通路、細胞周期、ErbB信號通路、子宮內膜癌、慢性粒細胞白血病、癌癥中的膽堿代謝、mTOR信號通路；與ANXA2基因有相關性的下調基因共有1 152個，富集在59個信號通路中，其中與腫瘤有相關性的有11個，分別是細胞因子受體相互作用、腫瘤壞死因子信號通路、局灶性粘連、細胞外受體相互作用、癌癥中的蛋白多糖、NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路、細胞黏附分子、細胞凋亡、Jak-STAT信號通路和MAPK信號通路，以上分析以富集倍數大于2的信號通路為篩選標準。見表1、2。

圖2 ANXA2基因在人膠質瘤及癌旁組織中的生存分析

2.4PPI網絡分析結果 篩選出與腫瘤有相關性的信號通路，再將34個基因富集在與腫瘤有相關性的信號通路中，進行PPI分析，并將其聚類在3個模塊中。分析其節點，發現TNFRSF1A、ICAM1、TGFB1、ITGB5、ITGB1是節點最多的基因，由此提示，這5個基因在ANXA2基因調控膠質瘤的生物表型中發揮重要作用。

2.5與腫瘤有相關性的通路基因的表達情況及生存期分析 相關基因表達分析顯示，與ANXA2表達有相關性的34個基因均為腫瘤組織中高表達的癌基因(P<0.05)。總生存期分析顯示，THBS1、RRAS、OSMR、IL13RA1、COL6A1、PLAUR、SOCS3、ITGB5、TNFRSF1A、ITGA5、IQGAP1、HSPB1共12個基因的表達與總生存期相關(P<0.05)。無病生存期分析顯示，TNFRSF12A、TGFB1、OSMR、LIF、ITGA5、ITGB5、TNC、THBS1、CACNA2D4、IL13RA1、COL6A1、CD276、ITGA3、CCL2、SOCS3共15個基因的表達與無病生存期相關(P<0.05)。其中，THBS1、OSMR、ITGA5、ITGB5、SOCS3、COL6A1、IL13RA1共7個基因的總生存期和無病生存期分析結果均顯示，其基因的異常表達與預后關系密切。綜合相關基因表達預后分析和PPI分析，除ICAM1和ITGB1外，TNFRSF1A、TGFB1和ITGB5均為與預后有相關性的基因。見表3。

表1 與ANXA2基因有相關性的上調基因富集的腫瘤相關信號通路

表2 與ANXA2基因有相關性的下調基因富集的腫瘤相關信號通路

表3 與腫瘤有相關性的通路基因的表達情況及生存期分析

3 討 論

膠質瘤約占中樞神經系統原發惡性腫瘤的80%，世界衛生組織將膠質瘤分為Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ級和Ⅱ級屬于低級別膠質瘤，Ⅲ級和Ⅳ級屬于高級別膠質瘤，其惡性程度越來越高。每個等級的臨床治療和預后不同；但絕大部分膠質瘤是Ⅲ級的間變性膠質細胞瘤和Ⅳ級的膠質母細胞瘤，基本無法治愈[8-9]。近年來對神經膠質瘤的研究趨向于基因治療學及分子生物學，發現某些細胞因子的表達能通過下游相關信號通路的變化，影響神經膠質瘤的惡性演變，加速或延緩病情的進展。因此，針對不同通路的靶向治療也成了研究熱點，隨著研究的深入，從分子水平調控神經膠質瘤的發生、發展成為可能。

本研究基于生物信息學分析軟件UALCAN、GEPIA和ONCOMINE的結果均顯示，ANXA2基因在膠質瘤中是明顯高表達的癌基因。與ANXA2基因有相關性的上調基因共有1 396個，富集在35個信號通路中，其中與腫瘤有相關性的有10個；與ANXA2基因有相關性的下調基因共有1 152個，富集在59個信號通路中，其中與腫瘤有相關性的有11個。ANXA2基因參與了細胞周期調控，這與鄧正海等[5]的研究，在U251和U87膠質瘤細胞株中沉默ANXA2基因的表達，可以抑制細胞周期蛋白D1的表達，將細胞周期阻滯在G1～S期的結果一致。ANXA2基因參與NF-κB信號通路，這與文獻[6-7]報道的ANXA2基因參與NF-κB信號通路介導的惡性膠質瘤血管生成、侵襲和轉移的結果一致。因此，借助于生物信息學軟件，明顯有助于開展腫瘤標志物的表型和機制研究，能避免機制研究的盲目性。

PPI分析發現TNFRSF1A、ICAM1、TGFB1、ITGB5、ITGB1是節點最多的基因，這5個基因在ANXA2基因調控膠質瘤的生物表型中發揮重要作用，而且，綜合相關基因表達預后分析和PPI分析，除ICAM1和ITGB1外，TNFRSF1A、TGFB1、ITGB5均為與預后有相關性的基因。這一結果為后期深入探討分子機制，提供了思路和研究切入點。

使用Human protein atlas分析預后生存期顯示，與ANXA2基因低表達組比較，ANXA2基因高表達組生存期縮短，預后相對較差。與腫瘤有相關性的信號通路的34個基因中，12個基因的表達與總生存期相關；15個基因的表達與無病生存期相關。ANXA2基因可能是膠質瘤中潛在的癌基因，與腫瘤有相關性并富集在20個信號通路中的基因的異常表達與膠質瘤預后明顯相關。因此，ANXA2基因表達上調在膠質瘤中的發生、發展及預后過程中發揮重要作用，并有望成為判斷膠質瘤患者預后的重要的腫瘤標志物。

近年來，采用生物信息學的方法，開展驅動基因、腫瘤標志物和信號通路的篩選，以及分子機制的研究，受到越來越多的關注，也越來越被學術界認可[10-15]，本研究主要從ANXA2基因表達水平改變、預后分析、參與的信號通路分析，以及高度相關基因的預后生存分析入手，對其基因的功能表型及調控膠質瘤進展的分子機制進行了生物信息學的研究和分析，結果對深入開展該基因調控膠質瘤表型的機制研究提供了依據，ANXA2基因有望成為膠質瘤診斷和治療的生物學標志物。

綜上所述，本研究借助于生物信息學軟件和數據庫分析后發現，ANXA2是膠質瘤中潛在的癌基因，篩選相關基因后進行信號通路富集分析，將獲得的腫瘤相關信號通路基因進行生存期分析和PPI分析，最終發現TNFRSF1A、TGFB1、ITGB5是ANXA2參與膠質瘤發生、發展及預后的關鍵基因。