TCF7L2基因rs7903146位點基因多態性與2型糖尿病合并冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的相關性研究*

駱時木，葉宇宸，歐陽航，葉玉華，張志珊

福建醫科大學附屬泉州第一醫院檢驗科，福建泉州 362000

轉錄因子7類似物2(TCF7L2)是一種轉錄因子，為高遷移率族蛋白家族的成員。研究發現TCF7L2基因多態性與2型糖尿病(T2DM)有關，在TCF7L2基因眾多單核苷酸多態性位點中，rs7903146位點是目前研究較熱門的位點之一，且被證實在不同的國家和人群中與T2DM易感性有緊密聯系[1-2]。該位點的多態性對靶基因啟動子的活性和轉錄概率的影響較強[3]，在Wnt信號通路中，TCF7L2自我表達的調節有重要作用[4]，但rs7903146位點與T2DM合并冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的相關性報道較少。本研究選擇TCF7L2基因rs7903146位點作為研究位點，旨在分析其與T2DM合并CHD的相關性及對體內血糖和血脂水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月至2018年6月本院內分泌科就診的T2DM患者100例為單純T2DM組，其中男58例、女42例，平均年齡(57.73±11.76)歲。診斷標準參照我國2007年糖尿病防治指南：有糖尿病癥狀并伴有隨機血糖≥11.1 mmol/L,或空腹血糖≥7.0 mmol/L，或既往有確切糖尿病病史，并在使用降糖藥物或胰島素者。選取同期本院心內科住院的CHD患者100例為單純CHD組，其中男67例、女33例，平均年齡(62.09±13.33)歲。CHD的診斷標準：冠狀動脈造影檢查證實冠狀動脈狹窄≥50%或既往有明確心肌梗死病史。選取同期心內科因CHD住院的T2DM患者100例為T2DM合并CHD組，其中男63例、女37例，平均年齡(65.28±11.22)歲。T2DM合并CHD的診斷標準同上。選取同期本院體檢中心的體檢健康者100例為對照組，其中男53例，女47例，平均年齡(53.35±10.96)歲，經檢查排除CHD，同時無高血壓、糖尿病等病史。所有研究對象主要來自福建泉州地區的漢族人群，無血緣關系。均排除肝臟疾病、腎病綜合征、甲狀腺或腎上腺疾病等影響血脂代謝的疾病，且近1個月內未使用降脂藥物。本研究得到了本院倫理委員會的批準，所有研究對象均在試驗前了解本研究的目的，并簽署知情同意書。

1.2方法 (1)標本采集：所有研究對象均禁食12～14 h后，于次日清晨采肘靜脈血2管。1管用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，進行糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測后，標本放置-80 ℃冰箱待提取基因組DNA。另1管不抗凝，于2 h內3 000 r/min離心5 min后分離血清，用于生化指標的檢測。(2)基因多態性檢測：采用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計TCF7L2基因rs7903146位點引物，上游為5′-AGT TTT ATT GGA GGG TTG CAC-3；下游為5′-TAG CGA AGA GAT GAA ATG TAG C-3′，引物由日本Takara公司合成。采用Qiagen試劑進行DNA的提取，BioTeke濃度檢測儀檢測其DNA濃度及純度。PCR反應總體積30 μL，包括10×buffer 3 μL，dNTP 2.4 μL，正向引物和反向引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，Taq酶0.15 μL及ddH2O 21.75 μL。PCR循環條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行35次循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物使用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳，溴化乙啶染色，使用凝膠成像儀觀察結果。擴增產物送北京六合華大基因科技有限公司進行測序，Chromas軟件分析測序結果。(3)生化指標檢測：采用高效液相色譜法(日本愛科來HA8180糖基化血紅蛋白儀)檢測HbA1c，采用美國貝克曼庫爾特全自動生化分析儀測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白(Apo)A、ApoB。試驗均嚴格按照標準操作規程進行操作，采用高低2個水平配套質控品進行質量控制，所有生化項目均取得中華人民共和國國家衛生健康委員會和福建省臨檢中心室間質量評價合格證書。

2 結 果

2.14組一般臨床資料比較 與對照組比較，T2DM組、CHD組、T2DM+CHD組年齡、體質量指數(BMI)、飲酒和吸煙人數，以及HbA1c、HDL-C、ApoA、ApoB水平差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2TCF7L2基因rs7903146位點基因型分析 經PCR擴增后，TCF7L2基因rs7903146位點基因片段為398 bp。將其DNA測序結果與GenBank參考序列比較，結果發現rs7903146位點存在2種基因多態性，CC基因型和CT基因型，未發現TT基因型，測序結果見圖1。

2.34組Hardy-Weinberg遺傳平衡分析 4組TCF7L2基因rs7903146位點多態性分布情況均符合Hardy-Weinberg平衡，對照組：χ2=0.066，P>0.05；T2DM組：χ2=0.222，P>0.05；CHD組：χ2=0.132，P>0.05；T2DM+CHD組：χ2=0.174，P>0.05)。所研究的基因型頻數和預期的基因型頻數相符合，具有群體代表性。

表1 4組一般臨床資料比較

組別TC(x±s,mmol/L)TG(x±s,mmol/L)HDL-C(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)ApoA(x±s,mmol/L)ApoB(x±s,mmol/L)對照組5.00±0.771.27±0.371.37±0.343.04±0.791.51±0.261.09±0.25T2DM組5.15±1.581.96±0.09a1.03±0.29a3.23±1.221.07±0.23a0.90±0.27aCHD組4.89±1.431.50±0.33b1.01±0.25a3.19±1.371.08±0.19a0.90±0.28aT2DM+CHD組4.69±1.43b1.97±0.41ac0.88±0.19abc2.90±1.071.01±0.18ab0.95±0.33a

注：A為野生型CC基因型；B為雜合型CT基因型。

2.44組基因型頻率分布比較 4組攜帶CT突變雜合子者29例，其中對照組5例，T2DM組9例，CHD組7例，T2DM+CHD組8例，4組基因型頻率分布組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.54組不同基因型生化指標的比較 4組TCF7L2基因rs7903146位點各基因型間相關指標水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.6T2DM合并CHD的Logistic回歸分析 將全部研究對象作為整體進行二分類Logistic回歸分析二分類劃分，將是否有T2MD合并CHD(否為0，有為1)作為因變量，其他指標作為自變量。結果顯示，高齡、高水平HbA1c是發生T2DM合并CHD的獨立危險因素，低水平HDL-C是預防T2DM合并CHD的保護因素。rs7903146位點基因型不是發生T2DM合并CHD的影響因素，見表4。

表2 4組基因型頻率分布比較(n)

表3 4組不同基因型相關指標的比較

表4 T2DM合并CHD的Logistic回歸分析

3 討 論

與T2DM相關的基因中TCF7L2基因是研究較為深入的基因之一。TCF7L2作為Wnt/β-連環蛋白途徑的核受體，在β-連環蛋白的誘導下結合基因中的Wnt反應元件[5]，β-連環蛋白與T細胞因子4形成復合物參與多種生物事件，特別是在胰腺和胰島發育中起著關鍵作用[6]，這影響著T2DM的發生與發展。此外，Wnt信號可利用β-連環蛋白/T細胞因子4介導腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子等多種靶基因的表達[7]，此類細胞因子可介導血管內皮炎性反應，促使血管壁增厚、管腔狹窄，從而增加心血管疾病的發病風險。

本研究通過對對照組、T2DM組、CHD組、T2DM合并CHD組TCF7L2基因rs7903146位點基因多態性分布分析發現，4組基因多態性分布差異無統計學意義(P>0.05)。此結果與陳鐵暉等[8]結果相符。在此前亦有許多關于TCF7L2基因rs7903146位點基因多態性的研究，但其結論不一，梁偉等[9]研究認為TCF7L2基因rs7903146位點多態性TT+CT基因型、等位基因T是T2DM患者的危險因素；王志強等[10]研究新疆維吾爾族人群也認為該位點與T2DM有關聯，CT基因型、T等位基因都是T2DM患者的危險因素，而也有學者研究該地區漢族人群則認為rs7903146位點基因多態性與T2DM不相關[11]；AXEL等[12]報道了奧地利人群中攜帶rs7903146 T等位基因的人群患CHD的風險較高，這種關聯在T2DM患者中較強，而CORELLA等[13]報道未發現rs7903146位點基因多態性與心血管事件的相關性。研究結果不一致可能是因為每個研究中患者的人口統計學和臨床特征不同，或者與不同環境因素有關。同時，不同種族及地域也有可能是其影響因素。在本研究中亦未發現研究人群 rs7903146位點基因多態性與T2DM合并CHD患者的聯系。

TCF7L2基因是利用Wnt通路來調節腸內分泌細胞中的胰高血糖素，從而影響血糖的平衡，亦有研究認為，TCF7L2基因多態性與脂類代謝有關[14]。PALIZBAN等[14]研究發現當rs7903146位點C突變成T時，在血脂異常中將發揮重要作用。CORELLA等[15]研究發現肥胖人群與rs7903146位點基因多態性有相互作用，與不肥胖者比較，肥胖患者發生T2DM的風險更高。有研究表明rs7903146位點基因多態性可能與糖尿病腎病、高血壓及血脂異常等發病機制有關[16-20]。趙曉宇等[21]報道在中國北方人群中 TCF7L2基因rs11196218位點A/G與血脂異常相關。因此，本研究還對各組CC、CT基因型的HbA1c和血糖、血脂指標進行比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究中Logistic回歸分析結果顯示高齡、高水平HbA1c是發生T2DM合并CHD的獨立危險因素，低水平HDL-C是預防T2DM合并CHD的保護因素，rs7903146位點基因型不是發生T2DM合并CHD的影響因素。

本研究顯示rs7903146位點各基因型生化水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但考慮到研究的樣本量不夠多，男女比例不平衡，組間年齡也有差異，且存在抽樣誤差的可能。因此，在評價結果時，需要考慮到這些因素不平衡帶來的影響。此外，遺傳背景、環境條件、生活方式、飲食習慣等諸多因素對疾病的影響亦不能忽視。

綜上所述，TCF7L2基因rs7903146位點基因多態性與T2DM合并CHD發病風險、血糖、血脂水平無關。