單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片與熒光原位雜交在流產絨毛組織遺傳學分析中的比較研究*

黃 艷，王曉華，侯東霞，白瑞芳，侯麗青，冀小平

內蒙古自治區(qū)婦幼保健院遺傳優(yōu)生科，內蒙古呼和浩特 010020

臨床上常用細胞染色體核型分析來診斷染色體疾病，雖然可以檢出所有染色體非整倍體的數目異常及>5 Mb的染色體結構異常[1]，但是傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)、染色體核型分析需要的工作周期較長(15個工作日)。熒光原位雜交(FISH)的最大優(yōu)勢在于不僅可用于中期染色體的檢測，而且可以用于間期核染色體的檢測[2]，同時也彌補了檢測周期的缺陷，約3～5個工作日可出結果。然而，FISH技術的高成功率僅表現于對染色體數目異常的檢測，不能檢測染色體的結構異常[3]。染色體微陣列分析(CMA)技術，包括微陣列比較基因組雜交技術和單核苷酸多態(tài)性微陣列(SNP-array)技術，是新近發(fā)展起來的一種快速、高效的分子核型分析技術，不僅能檢出拷貝數變異(CNVs)，還能檢測出雜合性缺失、單親二倍體和低水平的嵌合體[3-4]。本院自2016年開始開展SNP-array技術，臨床應用效果較好，本研究采用SNP-array技術和FISH技術對稽留流產絨毛組織進行檢測、比較，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年11月至2019年8月內蒙古自治區(qū)婦幼保健院稽留流產的632例患者為研究對象。納入標準：(1)符合稽留流產相關診斷標準[5]；(2)23～40歲；(3)流產孕周6～13周。排除標準：(1)有子宮內膜異位癥、子宮肌瘤等影響胚胎著床、發(fā)育的因素；(2)男方精子不成熟[5-7]。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法 隨機選取632例研究對象中181例患者作為試驗組，采用SNP-array技術檢測胚胎染色體；另選取451例患者作為對照組，采用FISH技術檢測胚胎染色體。

試驗組：無菌操作下取流產絨毛組織，離心，按總RNA試劑盒(德國Promega公司)要求抽提DNA，測定濃度和純度。按 Affymetrix Cytoscan 750K芯片的要求對提取的DNA進行操作，通過酶切、連接、擴增、純化、片段化、標記，與Affymetrix Cytoscan 750K芯片進行雜交、孵育、洗滌、染色。采用 Affymetrix Genechip Scanner 3000Dx掃描系統(tǒng)對數據進行采集，CHAS軟件進行分析。

對照組：去除蛻膜、血塊等雜質后，挑選絨毛組織5 mg剪碎成絨毛枝，進行消化、預固定、固定，將固定后的細胞懸液滴片，在73 ℃烤箱中烤片30 min。將制備好的玻片進行漂洗、消化、脫水后，加探針，76 ℃變性7 min后迅速置于37 ℃的水浴箱中，雜交前取出。選用特異性探針進行雜交過夜(條件42 ℃)。熒光顯微鏡下細胞計數>100個，當檢測到染色體異常>60%時為陽性，提示異常標本；<10%為陰性，提示正常標本；在10%～60%為嵌合體。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數據處理分析。計數資料以例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1兩組檢出染色體異常的種類 采用SNP-array技術成功檢測試驗組181例患者的絨毛組織，其中檢出染色體異常104例(57.46%)，包括非整倍體83例，整倍體10例，微缺失微重復CNVs 11例(2例CNVs致病性不明確的病例，夫婦拒絕芯片驗證，故無法獲得遺傳學來源)。對照組檢測451例，絨毛組織標本的間期FISH均獲得雜交信號，其中檢出染色體異常197例(43.68%)，包括非整倍體177例，整倍體20例。與對照組比較，試驗組對染色體異常的檢出率更高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.829 7，P<0.05)。

2.2兩組染色體非整倍體異常的檢出情況 試驗組非整倍體異常標本中，最常見的為16-三體，共16例，另有22-三體10例(含1例嵌合)，21-三體6例(含1例嵌合)，13-三體5例(含1例嵌合)；單體主要發(fā)生在X染色體(共10例)。對照組非整倍體異常標本中，以16-三體最多，共105例，另有45,X染色體30例，22-三體18例，21-三體11例，13-三體6例，18-三體3例，嵌合體及其他染色體異常4例。見表1。

2.3試驗組染色體微缺失微重復的檢出情況 試驗組中4例單一位點缺失或重復標本中，缺失2例，其中8號染色體缺失1例，17號染色體缺失1例；單一位點重復2例，其中X染色體重復1例，13號染色體重復1例；7例標本同時具有2個或2個以上的位點缺失或重復。另有結果顯示，試驗組SNP-array技術檢測出13q13.3q34二體、三體嵌合；對照組FISH檢測出16-三體和45,X染色體。見表2，圖1、2。

表1 兩組染色體非整倍體異常的檢出情況[n(%)]

表2 試驗組染色體微缺失微重復的異常情況

圖1 FISH檢測16-三體

圖2 FISH檢測45,X染色體

3 討 論

SNP-array技術可發(fā)現所有的染色體數目異常，可以識別并檢測染色體的重排，包括基因組序列的獲得與丟失，并且其可有效檢測出基因組所存在的不平衡問題[8-9]。SNP-array技術是通過檢測DNA CNVs實現的，結論可分為良性、可能良性、不明確、可能致病和致病5種類型[10]。結合基因組變異數據庫(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、人類染色體失衡和表型數據庫(https://decipher.sanger.ac.uk/)，以及專門收錄于基因組中(包括CNVs里可遺傳的或遺傳性基因疾病)的在線孟德爾遺傳性疾病數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)，可獲取具體的基因序列、位點、疾病及相關研究[11-12]，可以在線查詢相關CNVs的信息。SNP-array芯片檢測不能識別如下染色體異常：(1)平衡易位、倒位攜帶者；(2)低比例嵌合體者(嵌合率低于30%)。FISH技術是利用熒光標記的DNA探針與待測標本DNA序列進行雜交，針對常見的染色體非整倍體(13、16、18、21、22-三體及性染色體數目異常)，根據雜交信號的有無及類型達到診斷目的[13-15]。本研究通過SNP-array技術與FISH技術檢測流產絨毛組織，得出如下結論。

SNP-array技術的檢測范圍及檢出率高于FISH技術。孕婦發(fā)生自然流產的病因很復雜，胚胎或胎兒染色體異常是早期流產最常見的原因，約占50%～60%[16]。染色體數目異常是引起自發(fā)流產的最主要遺傳因素[17]，本研究表明，試驗組染色體數目異常(非整倍體和整倍體異常)共93例，占所有染色體異常的89.42%。FISH技術作為一種靶向檢測技術，不能對整個染色體組進行檢測。由于方法學的限制，FISH技術只能檢測13、16、18、21、22及性染色體的數目異常，其他染色體異常則無法檢測，也無法檢測這6條染色體探針區(qū)域以外的片段是否發(fā)生了缺失、重復、易位或倒位[18]。本研究中FISH技術對染色體異常的檢出率只有43.68%(197/451)；而SNP-array技術可發(fā)現所有的染色體數目異常，染色體異常的檢出率為57.46%。試驗組中除染色體數目異常還檢出CNVs 11例，其中5例為常規(guī)染色體核型分析無法發(fā)現的<10 Mb的CNVs。2例CNVs意義未明，需要夫妻雙方進行SNP-array技術驗證，只有檢測其來源，才能為下次妊娠提供指導，但夫婦拒絕驗證，因此無法進一步明確結果。試驗組對染色體異常的檢出率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.829 7，P<0.05)。

流產胚胎染色體以16-三體、22-三體和45，X染色體最常見。本研究中，試驗組用SNP-array技術檢出的染色體異常包括非整倍體、整倍體及染色體微缺失和微重復，其中染色體非整倍體發(fā)生率最高。試驗組染色體非整倍體異常的發(fā)生率為79.81%(83/104)，染色體非整倍體異常又以16-三體最為常見，22-三體和45，X染色體的發(fā)生率并列排第2位。對照組中染色體非整倍體異常的發(fā)生率為89.85%(177/197)，FISH技術檢測到的染色體異常以16-三體為最常見，其次是45，X染色體和22-三體，發(fā)生率排第2位和3位。

綜上所述，在檢查自然流產妊娠物染色體異常的效果上，SNP-array技術明顯優(yōu)于以往的FISH技術，值得臨床應用推廣。該技術在自然流產分子遺傳學分析中有顯著優(yōu)越性，因此，有必要對稽留流產患者進行SNP-array技術檢測，不但可以明確病因，更能為患者提供遺傳咨詢和再生育指導[19]。