CBX1在胃癌中的表達(dá)及與胃癌患者病理特征相關(guān)性的生物信息學(xué)分析*

吳 爽，張濤元，李 俏，曹三成，祝擷英△

1.西安交通大學(xué)附屬西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710003；2.日照心臟病醫(yī)院麻醉科，山東日照 276800

胃癌的惡性程度和病死率均較高，由于胃癌在早期缺乏特異性癥狀，導(dǎo)致其早期診斷率較低[1]。目前已發(fā)現(xiàn)許多基因參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但胃癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全被揭示[2]。人類基因組中CBX家族共包含8個(gè)基因，均與異染色質(zhì)、基因表達(dá)及生長(zhǎng)發(fā)育等生物過(guò)程密切相關(guān)。生物信息學(xué)技術(shù)分析結(jié)果表明CBX1在肝細(xì)胞癌、乳腺癌等多種癌癥中發(fā)揮重要作用[3]，然而其在胃癌中的作用機(jī)制仍不明確。

微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)已被廣泛用于鑒定基因組的表達(dá)水平，幫助識(shí)別與癌癥相關(guān)的差異表達(dá)基因和相關(guān)信號(hào)通路[4]。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析胃癌中CBX1的表達(dá)情況，探究CBX1與胃癌患者病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)聯(lián)，聚焦其在胃癌中可能參與的生物學(xué)過(guò)程，提供胃癌早期診斷和預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1CBX1在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異的驗(yàn)證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)[5]，比較CBX1在胃癌組織與正常胃組織中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異，同時(shí)獲取胃癌組織與正常胃組織中CBX1的研究數(shù)據(jù)，參數(shù)設(shè)置如下：t檢驗(yàn)，P=0.01，變化倍數(shù)為1.5倍，基因等級(jí)為10%，類型為mRNA。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤基因組圖譜與基因表達(dá)項(xiàng)目(GTEx)的數(shù)據(jù)，分析驗(yàn)證CBX1在正常胃組織與胃癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異，參數(shù)設(shè)置如下：方差分析，|Log2(FC)|最佳臨界值為1.0，q=0.01。

1.2蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗(yàn)證CBX1在正常胃黏膜細(xì)胞GSE-1和胃癌細(xì)胞SGC7901中的表達(dá)差異 兔抗人CBX1(PA5-28448)抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Ebioscience公司，GAPDH抗體購(gòu)自英國(guó)Abcom公司。將等量的正常胃黏膜細(xì)胞GSE-1及胃癌細(xì)胞SGC7901接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48 h以后提取蛋白，檢測(cè)濃度后，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，以GAPDH為內(nèi)參，分析兩種細(xì)胞中CBX1蛋白表達(dá)水平的差異。

1.3免疫組化驗(yàn)證CBX1在正常胃組織和胃癌組織中的表達(dá)差異 在Human Protein Atlas[6]網(wǎng)站(https://www.proteinatlas.org)中，利用免疫組化數(shù)據(jù)，從蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證CBX1在胃癌組織與正常胃組織中的表達(dá)差異，所用抗體為HPA031762。

1.4CBX1與胃癌患者臨床病理參數(shù)的分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)[7]，分析CBX1的mRNA表達(dá)情況與胃癌患者的癌癥分期和腫瘤分級(jí)之間的相關(guān)性。利用Kaplan Meier-Plotter在線分析工具，分析CBX1與胃癌患者總生存期(OS)的相關(guān)性。依據(jù)胃癌患者CBX1表達(dá)值的中位數(shù)，分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比、95%置信區(qū)間和相應(yīng)P值，制作生存曲線。

1.5CBX1關(guān)聯(lián)基因的篩選及富集分析 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與CBX1在胃癌中具有相似表達(dá)的基因，應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[8]及Scytoscape[9]軟件，構(gòu)建并可視化蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)；利用Metascape網(wǎng)站對(duì)相似基因進(jìn)行基因本體(GO)富集分析；利用Starbase網(wǎng)站進(jìn)行相似基因的京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，各數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CBX1的mRNA水平在胃癌組織的表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示：與正常組織比較，CBX1的mRNA水平在大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，見圖1A；其中有6組數(shù)據(jù)顯示CBX1的mRNA在胃癌組織中高表達(dá)，見圖1B、表1。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)胃癌中CBX1的mRNA表達(dá)情況加以驗(yàn)證，結(jié)果表明，CBX1的mRNA在胃癌組織高表達(dá)，見圖1C。

表1 不同類型胃癌與正常胃組織CBX1轉(zhuǎn)錄水平的變化(Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù))

2.2CBX1的Western blot結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示，CBX1在GSE-1細(xì)胞中的表達(dá)水平低于SGC7901細(xì)胞，即CBX1在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，見圖2。

2.3CBX1的免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，CBX1在正常胃組織中低表達(dá)，胃癌組織中高表達(dá)，見圖3。

注：A為CBX1在多種腫瘤中的表達(dá)情況；B為6組胃癌數(shù)據(jù)中CBX1的表達(dá)情況；C為CBX1在胃癌組織與正常胃組織中mRNA表達(dá)情況。

圖2 CBX1的Western blot結(jié)果

注：A為CBX1在正常胃組織中的表達(dá)情況；B為CBX1在胃癌組織中的表達(dá)情況。

2.4CBX1與胃癌患者病理參數(shù)的相關(guān)性分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CBX1進(jìn)行胃癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示在腫瘤分級(jí)中，正常組織vs.2級(jí)胃癌組織(P=1.56E-4)、正常組織vs.3級(jí)胃癌組織(P=4.12E-5)、1級(jí)胃癌組織vs.3級(jí)胃癌組織(P=0.00)的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4A；在癌癥分期中，正常組織vs.2期胃癌組織(P=9.98E-5)、正常組織vs.3期胃癌組織(P=5.58E-5)、正常組織vs.4期胃癌組織(P=9.46E-3)、3期胃癌組織vs.4期胃癌組織(P=4.22E-2)的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4B。利用Kaplan Meier-Plotter在線分析工具進(jìn)行CBX1與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)分析，并繪制生存曲線圖，結(jié)果顯示：CBX1高表達(dá)組患者的生存率遠(yuǎn)低于CBX1低表達(dá)組，見圖4C。

注：A為CBX1在不同的腫瘤分級(jí)中的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B為CBX1在不同癌癥分期中的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；C為CBX1表達(dá)與胃癌患者生存率的關(guān)系。

2.5CBX1在胃癌中的相似基因及其PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)，在胃癌組織中共獲得與CBX1表達(dá)有相似性的基因50個(gè)，在STRING網(wǎng)站中這些基因共構(gòu)建出含有51個(gè)點(diǎn)，985條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape 的MCODE插件，獲取其中相互作用程度最高的43個(gè)點(diǎn)，877條邊組成的核心網(wǎng)絡(luò)，見圖5。

圖5 CBX1的PPI可視化結(jié)果

2.6GO富集分析及KEGG通路富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示，43個(gè)基因的生物學(xué)功能主要聚集在組蛋白修飾、mRNA組裝及染色體有絲分裂過(guò)程，見6A。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，43個(gè)基因主要涉及的通路包括核糖體及氨基酸的生物合成途徑，見圖6B。

注：A為GO富集分析圖；B為KEGG通路富集分析圖。

3 討 論

目前，分子生物標(biāo)志物在疾病的診斷、預(yù)后和精準(zhǔn)治療中發(fā)揮重要的作用。隨著檢測(cè)技術(shù)和治療手段的提高，胃癌發(fā)病率有所下降，但仍是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤[10]。胃癌的危險(xiǎn)因素主要包括幽門螺桿菌感染、不當(dāng)飲食、不潔飲食及吸煙等，而早期診斷的缺乏和腫瘤的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散則是其主要致死原因[11]。因此，亟須探索更多的分子標(biāo)志物用于胃癌的早期診斷和靶向治療。

CBX1參與了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的遺傳調(diào)控過(guò)程[12]，有研究證實(shí)，CBX1能夠在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，且其高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)[3]；而在關(guān)于垂體瘤的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的CBX1能夠?qū)е麓贵w瘤的發(fā)生[13]；在前列腺癌中，CBX1高表達(dá)與組蛋白H3K3的甲基化密切相關(guān)[14]。本研究通過(guò)兩組不同來(lái)源的數(shù)據(jù)庫(kù)——Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)及GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)CBX1的mRNA水平在胃癌組織中明顯升高，之后利用Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CBX1蛋白在胃癌細(xì)胞SGC7901及胃癌組織中高表達(dá)，這些數(shù)據(jù)表明CBX1的高表達(dá)與胃癌有相關(guān)性。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床數(shù)據(jù)分析顯示，CBX1的mRNA表達(dá)在胃癌的不同分級(jí)、分期中均有差異，即隨著腫瘤的發(fā)展，CBX1的mRNA水平也隨之升高，預(yù)示著CBX1可以作為胃癌早期診斷及癌癥進(jìn)展的標(biāo)志物。生存分析結(jié)果顯示，CBX1高表達(dá)與胃癌患者的生存率相關(guān)，風(fēng)險(xiǎn)比高達(dá)2.09，提示CBX1可以作為胃癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。通過(guò)尋找在胃癌中與CBX1有相似表達(dá)的基因，篩選出43個(gè)作用緊密的基因集，富集分析顯示，這些基因主要參與組蛋白修飾、mRNA組裝及染色體有絲分裂等生物過(guò)程，這與CBX1參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控的功能類似，同時(shí)也與目前已經(jīng)報(bào)道的組蛋白和染色體對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制相吻合[13-14]。組蛋白的去乙酰化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，組蛋白H3和H4的乙酰化修飾被證實(shí)參與了胃癌的發(fā)生。染色體的非整倍性是腫瘤細(xì)胞的常見特征，也是腫瘤發(fā)生的原因之一，而一些針對(duì)有絲分裂紡錘體聚合物的藥物也早已被頻繁地用來(lái)治療各類腫瘤。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法，分析了正常胃組織與胃癌組織中CBX1的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)CBX1與胃癌的分級(jí)、分期和患者遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)，并分析了CBX1在胃癌中可能參與的生物學(xué)過(guò)程，有助于進(jìn)一步揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展可能涉及的分子機(jī)制，為胃癌提供早期診斷和預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物。但是，本研究有一定局限，缺乏有效的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)這些基因在胃癌組織中的功能進(jìn)行分析驗(yàn)證；同時(shí)，在進(jìn)行CBX1與胃癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)分析時(shí)，由于此數(shù)據(jù)分期與分級(jí)所納入病例數(shù)較少，有可能對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。盡管如此，本研究仍有利于全面深入了解胃癌的潛在分子機(jī)制，并為后續(xù)的分子生物實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，闡明了CBX1的表達(dá)與胃癌發(fā)生及胃癌患者病理參數(shù)之間的相關(guān)性，初步證實(shí)了CBX1可作為胃癌早期診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。