疑似中樞神經系統感染患者腦脊液病原體多重PCR檢測結果的研究*

吳婷娜，王旻晉，鐘方財，郭 碩，周妍冰，孟子芮，應斌武△

1．四川大學華西醫院實驗醫學科，四川成都 610041；2．四川省內江市第一人民醫院檢驗科，四川內江 641000

病原體侵入中樞神經系統(CNS)可引起感染性病變[1]，嚴重時可導致患者死亡。因此，早期、準確地診斷CNS感染是臨床治療的關鍵。目前，CNS感染的病原體檢測主要依靠腦脊液培養、涂片染色和特異性抗原抗體等方法，但檢測的靈敏度和時效性較低。

分子生物學診斷技術可以對病原體進行快速、準確的檢測，有利于CNS感染病原體的鑒別與診斷。腦膜炎/腦炎多重PCR(MEMP-19)檢測技術是將多重PCR擴增和毛細管電泳結合在一起的檢測技術，能夠針對19種臨床常見的CNS感染病原體進行檢測。與傳統方法比較，有靈敏度、特異度、通量均高的優點[2-4]。本研究利用MEMP-19技術對疑似CNS感染患者的腦脊液病原體進行檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據納入標準篩選后將擬研究病例分為疑似CNS感染組(A組)與非CNS感染的其他神經系統病變組(B組)，見圖1。A組68例，為疑似CNS感染入院治療的患者，臨床表現有疑似CNS感染的癥狀或體征，如發熱、頭痛、意識改變等，伴或不伴腦脊液異常，腦脊液白細胞數≥5×106/L，蛋白濃度>0.45 g/L；B組140例，包括顱內占位性病變、自體免疫性腦炎、神經系統退行性病變等臨床診斷為非CNS感染性疾病的患者。所有患者入院時間為2019年10-11月。腦脊液標本收集納入標準：(1)腦脊液標本量≥1 mL，紅細胞水平<10×1012/L；(2)腦脊液應在抗菌治療或免疫制劑治療前采集；(3)收集患者臨床信息。

1.2儀器與試劑 Easy-MAG核酸提取儀及其配套試劑購自上海梅里埃診斷產品有限公司；MEMP-19及其配套試劑購自寧波海爾施基因科技有限公司；ABI3500 Genetic Analyzer、 Applied Biosystems PCR擴增儀均購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.3方法 使用MEMP-19技術對納入病例的腦脊液標本進行檢測，包括19種CNS感染常見病原體：腦膜炎奈瑟菌、結核分枝桿菌(MTB)、單核細胞增生李斯特菌(LM)、肺炎鏈球菌、肺炎支原體(MP)、無乳鏈球菌、流感嗜血桿菌(HI)、大腸桿菌K1、腸道病毒(EVs)、人雙?？刹《?、乙型腦炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、巨細胞病毒(HCMV)、單純皰疹病毒(HSV)1型、HSV-2、EB病毒(EBV)、人類皰疹病毒6型及新型隱球菌(CN)。分析每種病原體的檢出率，并分析患者的單一感染率和混合感染率。

圖1 病例納入流程圖

2 結 果

2.1MEMP-19總檢出率 208例患者腦脊液標本中有43例檢出至少1種病原體，總檢出率為20.67%。EBV檢出率最高(11.54%)，其次是CN(5.77%)、MTB(3.37%)、EVs(3.37%)及HCMV(1.44%)，HI、HSV-2、LM及MP的檢出率均為0.48%。見表1。

表1 208例患者腦脊液標本病原體檢出情況(%)

2.2A組、B組檢出率情況 A組中有33例至少檢出1種病原體，檢出率為48.53%。主要是EBV(29.41%)、CN(17.65%)和MTB(10.29%)；B組共檢出6例EVs和4例EBV，檢出率為7.14%。見表2。

2.3單一感染與混合感染結果 A組的33例陽性標本中，單一感染21例(63.64%)，雙重感染10例(30.30%)，三重感染2例(6.06%)。雙重感染中，EBV與CN共感染5例、EBV與MTB共感染2例、EBV與HCMV共感染1例、MTB與HCMV共感染1例、EVs與CN共感染1例；三重感染中，EBV、MTB及HCMV共感染1例，EBV、CN及MP共感染1例；B組10例均為單一感染。見表3。

表2 兩組腦脊液病原體檢出情況(%)

表3 A組單一感染與混合感染的腦脊液病原體分布(n)

2.4A組MEMP-19檢測陽性和陰性患者的臨床表現及腦脊液指標比較 A組MEMP-19檢測陽性和陰性患者在發熱、頭痛、惡心嘔吐、意識改變、抽搐和腦膜刺激征方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，在腦脊液有核細胞計數及腦脊液總蛋白水平比較，差異亦無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 A組MEMP-19檢測陽性和陰性患者的臨床表現及腦脊液指標情況

續表4 A組MEMP-19檢測陽性和陰性患者的臨床表現及腦脊液指標情況

3 討 論

CNS感染是一種常見的感染性疾病，起病急、病情重且進展迅速[5]。常規實驗室檢查或臨床癥狀分析，難以準確診斷CNS感染的病原體。當前，分子生物學診斷技術正快速發展并應用于CNS感染病原體的實驗室檢測中，但仍存在諸多不足。實時熒光定量PCR可在較短時間內對一種或幾種已知病原體進行快速定性檢測，但無法用于病原體的高通量篩查；而基于新一代高通量測序技術的病原體檢測，可大幅提高對病原體的篩查、檢測能力[6]，但其需要專業的檢測平臺和人員[7]，且價格較為昂貴。本研究首次利用MEMP-19試劑盒對四川大學華西醫院208例患者的腦脊液標本進行了病原體檢測，在疑似CNS感染組中有48.53%的患者檢出病原體，并發現共感染情況。

本研究中A組檢出的病原體以EBV(29.41%)和HCMV(4.41%)較為常見，且存在單一感染和共感染并存的情況，這與既往CNS共感染相關研究一致[8-10]。此外，有研究顯示，EBV和HCMV是常見的機會性感染病原體[11-12]，可累及多器官系統出現臨床癥狀和持續感染，免疫力低下患者，尤其是合并人類免疫缺陷病毒感染的患者，應考慮EBV和HCMV潛伏感染的可能[13-14]。故僅腦脊液EBV和HCMV檢測陽性并不能診斷CNS感染，必須結合臨床癥狀綜合考慮。

此外，A組CN檢出率為17.65%，12例檢出CN的患者中，5例單一感染，7例共感染。CN為條件致病性真菌，是免疫功能低下患者CNS感染常見的病原體[15]，在免疫功能低下患者出現CNS感染癥狀時，應考慮隱球菌性腦膜炎的可能。

結核性腦膜炎是最嚴重的肺外MTB感染所致的疾病之一[16]。本研究中A組共檢出7例MTB，檢出率為10.29%，它們的常規腦脊液培養和抗酸染色檢測結果為陰性。由于結核性腦膜炎的非特異性臨床表現增加了臨床診療難度，因此病原學檢測對結核性腦膜炎的臨床診斷非常重要，而傳統的MTB檢測主要是抗酸染色鏡檢及培養，檢出率低且培養耗時。因此，MEMP-19檢測非常適用于MTB的臨床快速篩查和檢測。

除此之外，A組還檢出HI、LM、MP等病原體，但常規腦脊液培養均為陰性。結合臨床癥狀及隨訪治療效果進行分析，確認MEMP-19的檢測結果可信。這充分證明了MEMP-19相比傳統的實驗室檢測方法，能夠更加準確地對疑似CNS感染病例的腦脊液病原體進行檢測。結合臨床信息進行分析發現，A組MEMP-19陽性和陰性的患者在臨床癥狀和體征，以及腦脊液生化指標方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，這與伊潔等[17]報道的結果一致，提示MEMP-19檢測結果與患者的臨床表現沒有相關性，而可能與感染病原體毒力和機體免疫力有關。

值得注意的是，本研究中B組檢出EVs及EBV。研究顯示，EVs等嗜神經性病毒可建立CNS持續性感染，如脊髓灰質炎病毒RNA在感染數年后仍能在腦脊液中檢測到[18]。最近一項研究證明在CNS感染中持續檢測到EVs序列與肌萎縮側索硬化的惡性發展相關[19]。也有報道顯示，EBV在其原發感染后即建立終身潛伏感染并潛伏于B淋巴細胞，由此可在無CNS感染臨床癥狀時檢測到[20]。因此，臨床需重視病原體在CNS中的潛伏感染和引起相關并發癥的情況。

本研究顯示，MEMP-19對腦脊液病原體有較好的檢出效果，其耗時短、特異性強且能同時檢測多種病原體，因而可為臨床提供早期、快速、可靠并且更加全面的病原學檢測結果，可提高CNS感染的臨床診斷效能。與傳統的病原體檢測手段比較，MEMP-19檢測CNS感染為實驗室診斷提供了新思路。