泛基因組研究在遺傳多樣性和功能基因組學中的應用

向坤莉 賀文闖 鄒益 彭丹 張曉妮 廖雪竹 王杰 楊健康 武志強

摘 要：相對于單個參考基因組僅聚焦于個體遺傳信息的挖掘，泛基因組研究則能夠反映整個物種或類群全部的遺傳信息。隨著基因組測序和分析技術的不斷發展，泛基因組學逐漸成為新的研究熱點，并已在植物、動物和微生物多個物種中獲得了廣泛應用，為全面解析物種或類群水平的遺傳變異和多樣性、功能基因組和系統進化重建等研究提供了強有力的工具，取得了很多顯著的研究成果。盡管如此，由于泛基因組學研究尚處于發展階段，測序費用和分析成本仍然較高，難以廣泛普及;且存在分析標準不一、數據挖掘不夠全面深入、理論難以應用于生產實際等尚待解決的問題，仍有較大的發展空間。該文系統總結了泛基因組在生物遺傳多樣性挖掘和功能基因組學中的研究進展，主要包括其在泛基因組圖譜的構建、基因組變異和有利基因的發掘、功能基因的多態性、群體遺傳多樣性和系統進化等多個領域中的應用和研究，探討了其在不同領域的應用潛力。同時，討論了目前泛基因組研究中存在的局限性和可能的解決方法，并對其將來的發展前景進行了展望。

關鍵詞：泛基因組，結構變異，功能基因，遺傳多樣性，系統進化

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）10-1674-09

Abstract：The pan-genome can represent all of the genetic diversities in a species or population，which is a limitation for obtaining only one single reference genome. The pan-genomics is becoming a new hot research area and being widely applicated in researches of many species in plants，animals and microorganisms，as the development of the whole genome sequencing and analysis technology. It provides powerful tools for resolving the genetic variation and polymorphism at levels of species or taxa，researches of functional genomics and reconstruction of phylogenetics，obtaining abundant of significant research achievements. However，present researches on pan-genomics still need to improve due to several problems，e.g.，extensive cost of whole genome sequencing and data analysis，inconsistent analysis standards，lack of deeper and comprehensive explanation of the obtained data，and difficulty of application of the research achievements. We summarized the research progresses of pan-genomes on exploitation of genetic diversity and functional genomics，including construction of a pan-genome map，identification of genome variations and favorable genes，polymorphism of functional genes，population genetic diversity and systematic evolution，and discussed its potential in application of different research fields. Furthermore，we discussed the limitations existed in the present studies and possible solutions，and presented the prospect in the future on pan-genomics.

Key words：pan-genome，structural variants，functional gene，genetic diversity，systematic evolution

遺傳變異是生物進化的內在源泉，因而，研究遺傳多樣性及其演化規律是生物遺傳學及進化生物學研究中的核心問題之一。而泛基因組研究則是近年來隨著測序成本的急劇降低和分析技術的快速發展而全面反映物種遺傳變異的一種新興工具。泛基因組研究能夠從物種或類群水平廣泛發掘和利用遺傳變異多樣性，是現代醫學、生物學、農學中的一個前沿領域。其中，泛基因組（pan-genome）指一個物種或者類群的全部基因組信息的集合，包括核心基因組（core genome）和非必須基因組（dispensable genome）兩部分。核心基因指在所有個體中都存在的基因/組分集合;而非必須基因組是指在部分個體或單個個體中存在的基因/組分集合，有時也稱為可變基因組（variable genome） （圖1; Tettelin et al.，2005; Medini et al.，2005）。核心基因組由所有樣本中都存在的序列組成，往往與重要的生物學功能和表型特征相關，多數是一些管家基因（house-keeping genes），反映了物種的穩定性;可變基因組由僅在部分樣本中存在的序列組成，一般與物種對特定環境的適應性或特有的生物學特征相關，反映了物種的多樣性和特異性（Montenegro et al.，2017; Gordon et al.，2017; Wang et al.，2018; Zhao et al.，2018; Liu et al.，2020）。

當前，泛基因組研究已經廣泛應用于多個植物、動物和微生物物種中，為全面解析物種或類群水平的遺傳變異、功能基因研究和系統進化重建等研究提供了強有力的工具，取得了很多顯著的研究成果（付靜和秦啟偉，2012; 王婭麗等，2019; Tian et al.，2019; Chen et al.，2020; Domínguez et al.，2020; Weissensteiner et al.，2020; Liu et al.，2020）。然而，現有的泛基因組學研究主要聚焦于不同個體基因組序列和基因結構的變異（Montenegro et al.，2017; Zhao et al.，2018; Gao et al.，2019; Liu et al.，2020），但對這些變異如何介導基因結構和功能的改變，最終影響生物表型，以及這種遺傳差異如何與環境因子互作，都未能進行深入探討。本文綜述了泛基因組學在不同物種中的研究進展，對其在群體基因組變異、功能基因的鑒定和發掘、群體遺傳多樣性和系統進化等多個領域中的應用與研究進行了系統性總結，并對其應用前景和局限性進行了探討。

1 泛基因組圖譜的構建

最早在2005年，Tettelin et al.（2005）在對幾種鏈球菌屬細菌（GBS，group B Streptococcus）的遺傳多樣性研究中提出微生物的泛基因組概念，指出核心基因組是在所有菌株中都存在的基因;非必須基因組（可變基因組）是僅在部分菌株中存在的基因。其中GBS菌共有的核心基因組占80%，剩余20%的基因組信息為非必須基因組。隨后，2010年Li et al. （2010）通過對多個人類個體基因組進行組裝和比較基因組學分析，提出了“人類泛基因組”的概念，也就是人類群體基因組信息的總和，并從中鑒定獲得新發現的序列達到19～40 Mb。而隨著千人基因組計劃的提出和實施，泛基因組在人類疾病方面的研究取得了許多重大突破，為精準醫療計劃提供了可能（1 000 Genomes Project Consortium，2012）。

之后，隨著越來越多的物種完成了高質量基因組參考序列的組裝，多個動植物物種中相繼報道了泛基因組圖譜的構建相關研究工作。例如，通過對全球12個種豬品種的基因組進行高質量組裝，構建了豬的泛基因組圖譜，發現中國的豬品種有大約9 Mb的泛序列（pan-sequences）與歐洲的豬品種存在差異，其中包括脂肪細胞脂解的必要調節因子TIG3 （Tazarotene-induced gene 3）（Tian et al.，2019）;對19個小麥品種的泛基因組分析發現，平均每個樣本中含有128 656個基因，核心基因有89 795個（Montenegro et al.，2017）;利用725個番茄品種的基因組信息構建的番茄泛基因組圖譜中，整個番茄泛基因組共包含40 396個基因，其中74.2%是核心基因（Gao et al.，2019）。此外，泛基因組在水稻（Schatz et al.，2014;Yao et al.，2015; Sun et al.，2017; Wang et al.，2018; Zhao et al.，2018; Zhou et al.，2020）、大豆（Li et al.，2014; Liu et al.，2020; 祝光濤和黃三文，2020）、玉米（Hufford et al.，2012; Hirsch et al.，2014; 簡銀巧等，2017）等重要的植物物種均獲得了廣泛應用（表1）。因此，構建整個物種的泛基因組圖譜已成為廣泛應用的基因組學方法，不僅能夠發現全面的遺傳信息，而且能為從物種和群體水平進行功能基因組學、系統進化和其他生物學研究提供更強有力的工具。

2 泛基因組學研究中序列結構變

異與功能基因發掘

同一物種內一個或幾個參考基因組能夠反映的遺傳變異是非常有限的，而泛基因組研究能夠覆蓋物種或類群中的所有變異，為研究整個物種或類群水平上的基因組序列和結構變異提供了可能。現代生物基因庫中的遺傳變異通常包括單核苷酸多態性（SNPs，single-nucleotide polymorphisms）、插入缺失（Indels，insertions and deletions）和大的結構變異（SVs，large structural variants）。其中SVs主要包括拷貝數變異（CNVs，copy number variants）、存在/缺失變異（PAVs，presence/absence variants）、移位（translocation events）和倒置（inversion events）等，而這些變異往往和一些關鍵的農藝性狀相關（Springer et al.，2009; Hirsch et al.，2014; Li et al.，2014; Lu et al.，2015; Zhao et al.，2018）。

通過泛基因組分析全面發掘群體基因組中的序列和結構變異，能夠鑒定其中與有利表型相關的變異位點，為發掘和研究新的功能基因提供了重要依據。例如，利用 66個水稻高質量基因組構建了水稻的泛基因組，從中共鑒定到16 563 789 個SNPs、5 549 290個Indels和933 489個SVs，分析了其中與開花時間相關的基因Hd3a （Heading date 3a）、抗寒性基因COLD1 （Chilling tolerance divergence 1）、谷物重量基因GW6a （Grain weight 6a）、分蘗角度基因TAC1 （Tiller Angle Control 1）、植株高度基因Sd1 （Semi dwarf 1）在不同材料間的遺傳變異，表明SNPs變異是導致這些基因變異的基礎（Zhao et al.，2018）。而利用29個高質量基因組構建的大豆泛基因組圖譜，共鑒定獲得14 604 953個SNPs、12 716 823個Indels和776 399個SV（包含723 862個PAVs、27 531個CNVs、21 886個移位和3 120個倒置），發現有些結構變異在重要農藝性狀調控中發揮重要作用，如PAV、基因融合和Indels分別對種皮亮度、種皮顏色的馴化、缺鐵失綠等性狀具有重要影響（Liu et al.，2020）。

同時，在不同層次上發現的多個序列和結構變異，不僅提供了更加豐富的變異信息，也為研究基因功能變異提供了更多素材。例如，通過六倍體普通小麥物種基因組間和亞基因組間的共線性分析，提出其“4A-5A-7B染色體重排”是兩次染色體易位事件的結果，并明確了重排的基因組區間的精細邊界;并且在微觀尺度上探討了小麥春化基因Vrn2 （Vernalization2）的復雜進化歷史，發現Vrn2同源基因在普通小麥基因組中的復雜分布是包含串聯重復、多倍化、染色體易位和基因丟失在內的一系列事件疊加的結果（Chen et al.，2020）。另有研究利用100個番茄基因組捕獲到238 490個SVs，構建得到泛結構變異（panSV）圖譜，研究表明SVs是許多轉座子的基礎，而且SVs集中區域的基因漸滲現象嚴重，且群體中90%的SVs變異可在泛基因組圖譜中獲得驗證（Alonge et al.，2020）。

3 泛基因組學研究中功能基因的

變異與多態性

遺傳結構變異通常會導致基因功能的改變，泛基因組研究能夠通過全面整合相關基因的遺傳信息，揭示基因重組、融合等事件導致基因功能的獲得、丟失，以及發掘新基因。例如，大豆缺鐵萎黃病有關的候選基因被定位于14號染色體上，通過泛基因組研究發現該候選基因有兩種單倍型：品種“中黃13”所屬的單倍型主要分布在低緯度地區;品種“威廉82”所屬的單倍型主要分布在高緯度地區，能夠在高pH值、鐵為不易吸收的難溶氧化物等環境中生存，這種單倍型啟動子區有1.4 kb 的Indel和外顯子區有5個變異位點（Liu et al.，2020）。在油菜中通過全PAV-GWAS （genome wide association study）分析發現3個開花抑制因子BnaA10.FLC、BnaA02.FLC和BnaC02.FLC的PAVs與油菜的開花時間和生態型分化密切相關，其中：冬油菜品種的BnaA10.FLC啟動子區都含有MITE （miniature inverted repeat transposable element）插入;85%春油菜品種的BnaA10.FLC第一個外顯子中含有LINE （long interspersed nuclear elements）插入;81%半冬性油菜品種的BnaA10.FLC啟動子區含有hAT插入。表明BnaA10.FLC決定了油菜生態類型，是控制油菜開花的關鍵基因（Song et al.，2020）。

生物的表型往往是來自多個基因網絡調控的結果，其中很多基因可能又同時對多個不同的表型性狀具有影響，因此對某個表型的有利基因亦有可能對另一個表型具有不利影響。例如，現代番茄中的產量相關性狀調控機制復雜，對100個番茄基因組的泛結構變異（pan-SV）的研究發現，由四個結構變異導致形成了三個MADS-Box基因，共同影響番茄的經濟性狀。其中j2TE基因型具有便于收獲的無關節花梗表型，而ej2w基因型具有防止撞傷的大花萼表型，但兩個基因型同時存在（j2TE ej2w）則會出現花序分枝過多而導致低育性的現象;sb1（suppressor of branching 1）基因型能有效克服雙隱性基因型的負面作用，實現增產;另外，sb1基因型的表達可能受1號染色體上STM3基因的串聯重復序列影響，且串聯重復的拷貝數具有劑量效應 （Alonge et al.，2020）。因此，通過在更廣泛的群體中研究基因功能變異對表型的影響，將有助于更加準確地對功能基因-表型的關聯做出全面詳細地評估，從而更好地指導分子育種工作來培育出抗病性更強、產量更高、保質期更長、風味更好的作物品種，同時又不犧牲其他所期望的表型性狀。作物泛基因組學研究已經發現了大量農藝表型與特定基因的存在、缺失和變異之間的多樣化的相關性（Tao et al.，2019），通過在泛基因組完整遺傳圖譜的基礎上進行研究，將有利于徹底澄清其內在關聯和相應的機理。

4 泛基因組學研究在種群遺傳多樣性和系統進化研究中的應用

對泛基因組學的研究，不僅可以全面地從基因組水平分析物種內遺傳多樣性，探究個體間的系統發生關系和表型差異的遺傳基礎，而且可以從物種、亞種水平分析基因組的序列變異和系統進化特征，為研究物種的起源及演化等重要生物學問題提供依據。例如，通過水稻泛基因組對6個水稻群體中與馴化有關的7個基因位點開展進化分析，發現Aus群體（Indica的一個亞類群）并未全部聚在栽培稻進化分支上，從而提出Aus水稻群體處于不完全馴化選擇狀態（Zhao et al.，2018）。利用小麥泛基因組對19個小麥個體基因的PAVs進行了發掘并構建了系統進化樹，發現小麥品種‘中國春’位于進化樹的基部，為小麥不同類型種質的系統進化關系和研究利用提供了理論依據（Montenegro et al.，2017）。對32只烏鴉群體的泛基因組研究，將鴉屬（Corvus）分為Jackdaw和Crow兩大支系，并在此基礎上探討了不同進化分支上烏鴉的基因組結構變異和功能性狀，尤其是發現烏鴉羽毛圖案差異大，但遺傳差異不大，主要受NDP 基因上游20 kb處一個大小為2.25 kb的LTR （long terminal repeats）逆轉座子插入調控 （Weissensteiner et al.，2020）。

泛基因組研究還可運用于對不同生態地理類型中差異較大的種質資源進行基因組測序，挖掘物種中新的基因，為候選基因的補充、物種多樣性及適應性進化、起源經歷和外來物種入侵性等問題的研究提供重要信息。例如，大豆群體的生物地理分析發現現代栽培大豆起源于中國的華北地區（Liu et al.，2020），而水稻群體的相關研究發現現代栽培稻起源地應該包括中國華南地區（Huang et al.，2012）。此外，由于一些作物的基因庫中包括多個物種，特別是具有不同遺傳結構的野生近緣物種，需要構建含該作物所有品種及其近緣種的遺傳圖譜以進行更廣泛的研究，因此也有學者提出了超-泛基因組（super-pan-genome）的概念，以探討更大范圍種質群體的遺傳基礎及其多樣性（Khan et al.，2020）。

5 泛基因組學研究的發展前景

真核生物的全部基因組信息包括核基因組、線粒體基因組和質體基因組。目前的泛基因組學研究大多關注的是核基因組，而線粒體和質體這兩種細胞器的泛基因組研究也逐漸開始被重視。例如，研究者利用PCAWG （The Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes） 數據庫中2 658個癌癥樣本及其匹配的正常組織樣本的全基因組數據構建了人類線粒體基因組最全面的突變藍圖，并確定了多個高度突變類型，其中截斷突變（truncated mutations）在腎臟癌癥、結直腸癌和甲狀腺癌中明顯富集，提示了激活特殊的信號通路或會帶來致癌影響（Yuan et al.，2020）。此外，有研究者利用321個辣椒的葉綠體基因組，構建了辣椒5個栽培種及2個變種的葉綠體泛基因組，其不但用系統發育信號分析揭示了辣椒屬不同種間親緣關系的遠近，也對7個葉綠體泛基因組的CDS （coding sequence）、內含子和基因間隔區的遺傳多樣性進行了詳盡分析，確定了rpl23和trnI的基因間隔區包含44 bp串聯重復以及其他插入缺失和單核苷酸等豐富的變異（Elmosallamy et al.，2019）。

在某些物種中，由于其基因組較大和可移動元件的比例較高等原因，使得泛基因組研究難以有效開展，因此，關注全部RNA信息的泛轉錄組（pan-transcriptome）研究開始逐漸興起。許多重要作物，如玉米（Hansey et al.，2012; Hirsch et al.，2014; 簡銀巧等，2017）和大麥（Ma et al.，2019），以及模式生物擬南芥（Gan et al.，2011）等的泛轉錄組研究均已有報道。

隨著多種測序技術的結合和分析策略的發展，泛基因組學相關研究呈現爆發式增長，但是大多數研究的深入程度不一，許多數據結果仍有進一步深入挖掘的空間。尤其是構建完整的基因圖譜后，很多研究止步于對某幾個基因的結構變異進行鑒定，未進一步開展系統的功能研究，更不用說應用于生產實踐。此外，隨著大量生物信息學數據的積累，單個團隊面對浩大的數據庫也只能選擇部分數據結果進行深入研究，難以充分利用現有的數據。例如，人類基因組計劃從開始啟動到現在已經過去30年，仍需大量的人力投入和研究分析去解決更多的問題。因而，完善的數據共享機制和良好平臺是泛基因組學研究良性發展和應用的一個重要條件。目前，我國已建立了國家基因組科學數據中心（NGDC，National Genomics Data Center），某些重要農作物或農業動物物種的泛基因組數據也建立了數據分享平臺，如豬的泛基因組數據庫PIGPAN （http：//animal.nwsuaf.edu.cn/code/index.php/pan-Pig）、大白菜基因組數據庫BRAD （the Brassica database，http：//brassicadb.cn）和油菜泛基因組資源數據庫（http：//cbi.hzau.edu.cn/bnapus/）等。

一方面，進一步整合更廣泛的多層次群體基因組數據，如不同世代之間的泛基因組研究、整合多個物種的超-泛基因組研究等，可能是值得進一步探索的新方向（圖2）。另一方面，隨著測序技術的不斷發展，尤其是單細胞測序技術的發展和測序成本的進一步降低，單細胞分辨率的轉錄組圖譜已經逐步開始在水稻和玉米的根發育研究中獲得應用（Satterlee et al.，2020; Liu et al.，2021）。因此，同一個體不同組織器官的泛基因組或泛轉錄基因組研究，乃至不同細胞之間的泛基因組或泛轉錄基因組研究也可能成為新的發展方向（圖2）。

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（責任編輯 周翠鳴）