狄斯瓦螨對意大利蜜蜂工蜂呼吸代謝的影響

譚 靜, 武江利, 涂洋洋, Tessema AYNALEM,2, 于慧敏,李南南, 李小英, 徐書法，*

(1. 中國農業科學院蜜蜂研究所, 農業農村部授粉昆蟲生物學重點實驗室, 北京 100093;2. College of Agriculture and Environmental Science, Bahir Dar University, P. O. Box 5501, Bahir Dar, Ethiopia)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(簡稱“意蜂”)是一種重要的經濟昆蟲，不僅為人類提供多種綠色健康的蜂產品，而且作為重要的授粉昆蟲，每年為全球價值2 150億美元的農作物進行授粉(Brittain and Potts, 2010; Gilletal., 2012; Smithetal., 2013)。近年來，全球出現的蜂群損失現象使養蜂業和依賴蜜蜂授粉的種植業受到嚴重威脅(Piouetal., 2019)。狄斯瓦螨Varroadestructor隸屬節肢動物門(Arthropoda)蜱螨亞綱(Acari)寄螨總目(Parasitiformes)瓦螨科(Varroidae)(Anderson and Trueman, 2000)，是威脅蜜蜂健康最為嚴重的致病因子，不僅可通過寄生在蜜蜂身體上消耗脂肪體來損害蜜蜂健康(Ramseyetal., 2019)，還可通過攜播病毒的方式，影響蜜蜂新陳代謝、抑制免疫及縮短壽命(Annosciaetal., 2012; Nazzietal., 2012)。

呼吸代謝是一切生命活動的基礎，通過研究昆蟲呼吸代謝的變化規律，對于分析其對環境的適應性、了解代謝底物的利用情況以及評價昆蟲機體的生理狀態具有重要意義(Slamaetal., 2007; DeVries and Appel, 2013; 王冬梅等, 2014; DeVriesetal., 2015)。蜜蜂作為一種完全變態的社會性昆蟲，在不同的條件下，其呼吸代謝存在不同的變化特征。Allen(1959)研究發現，出房18 h后的工蜂隨日齡增加呼吸代謝不斷升高，在2日齡時工蜂呼吸率最低；Jungmann等(1989)采用瓦氏微量呼吸儀和氣體分析儀分析發現，蜜蜂在靜止狀態下的呼吸率顯著高于飛行狀態；夏邦穎和郭郛(1965)利用瓦氏微量呼吸儀分析發現，生殖型個體(蜂王和雄蜂)的呼吸代謝高于非生殖型個體(工蜂)；繆曉青等(2001)利用DKW-3型微量呼吸檢壓儀研究發現，意蜂工蜂蛹期呼吸商(respiratory quotient, RQ)明顯高于中華蜜蜂Apisceranacerana；盧宜娟等(2008)利用華勃式微量呼吸檢壓儀測定發現，中華蜜蜂和意大利蜜蜂受精卵在不同發育時間其耗氧量存在明顯差異，可能與受精卵內在發育機制的調控相關。目前，影響蜜蜂呼吸代謝的因素的研究多集中在溫度、種類、日齡、行為等方面，而關于在寄生蟲等生物危害因子對蜜蜂呼吸代謝的影響方面研究較少，尤其是狄斯瓦螨這一重要的全球性蜜蜂寄生蟲對宿主呼吸代謝的影響未見報道。本研究通過測定狄斯瓦螨侵染不同發育時期意蜂的耗氧量、CO2釋放量和呼吸商，分析染螨后意蜂成蜂呼吸相關基因的表達量變化規律，以期明確在狄斯瓦螨侵染下意蜂呼吸代謝的變化規律，為今后深入研究狄斯瓦螨與意蜂之間的相互作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 意蜂蟲源及處理

實驗材料于2019年8月取自中國農業科學院蜜蜂研究所蜂場。實驗分為染螨組和對照組，每組分為3個重復。染螨組：選取3群群勢大小一致(同種同日齡蜂王，健康蜂群)的蜂群，通過限王產卵的方法，在蜂王產卵后將其移出。實驗中，為獲得準確日齡的實驗用蜂，我們對相同日齡的幼蟲、蛹在巢框上標記，對新出房成蜂進行蜂體標記。狄斯瓦螨取自中國農業科學院蜜蜂研究所染螨實驗蜂群，參考Dietemann等(2013)的方法，于幼蟲封蓋前1 d接螨(每蜂群1頭)，放入健康蜂群中進行標記、觀察。對意蜂工蜂4日齡幼蟲、5日齡蛹、新出房成蜂、出房后第6日成蜂分別采樣，其中染螨組以觀察到意蜂體有螨寄生時取樣。對照組：選取3群群勢大小一致的不接螨健康蜂群作為對照，實驗方法及標記方法與染螨組相同。

1.2 意蜂呼吸代謝指標的測定

選取4個發育時期(4日齡幼蟲、5日齡蛹、新出房成蜂和出房后6日齡成蜂)意蜂工蜂放入SSI多通道昆蟲呼吸儀(Sable System International Inc.)的呼吸室內(圖1)，恒溫水箱溫度控制在34.5±0.05℃。呼吸室的連接處均涂有油性物質，以保證呼吸室的密閉性，用CaSO4干燥劑除去從空氣中進入到多通道昆蟲中呼吸儀的水。調整進氣流速為90 mL/min，待整個測量裝置穩定后，將待測意蜂放入呼吸室測量，每頭蜜蜂測試時間為3 min，數據通過ExpeData程序軟件進行儲存和分析。樣本均實行單頭測試，第一通道為空白管，用于校準基線。每個時期重復5次，每次測量7頭蜜蜂。

圖1 SSI多通道蜜蜂呼吸測定示意圖

1.3 呼吸代謝相關基因表達量的實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定

用Trizol(Invitrogen產品)分別提取6日齡染螨成年工蜂和健康成年工蜂的RNA，隨后按照第1鏈合成試劑盒HiFiScirpt cDNA(康為世紀)的操作說明進行cDNA第1鏈的合成。采用Primer Premier 5.0 設計特異性引物，分別設計5個呼吸相關基因的RT-qPCR引物(表1)，以β-actin作為內參基因。根據SYBR FAST qPCR Kit(KAPA Biosystems, KK4601)的說明配制反應體系，每個樣本設3個重復。反應條件： 95℃ 5 min; 95℃ 3 s, 60℃ 30 s, 40個循環；熔解程序： 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 95℃ 15 s, 每0.6℃進行 1 次熒光監測。利用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

表1 RT-qPCR所用引物信息

1.4 數據處理

使用單因素方差(ANOVA)分析不同時期染螨意蜂和健康意蜂耗氧量(mL/min)、CO2釋放量(mL/min)和呼吸商變化，Duncan氏多重比較分析差異顯著性(P<0.05)。利用獨立樣本t檢驗分析染螨成蜂與健康成蜂耗氧量、CO2釋放量和呼吸商以及呼吸相關基因表達量的差異顯著性(P<0.05)。采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理。

2 結果

2.1 染螨意蜂與健康意蜂工蜂耗氧量的比較分析

染螨意蜂與健康意蜂工蜂個體平均耗氧量如圖2所示。結果表明，在4日齡時，染螨意蜂與健康意蜂幼蟲期耗氧量一致，均為0.0095 mL/min。健康意蜂耗氧量從4日齡幼蟲至出房后6日齡成蜂呈逐漸上升趨勢，至6日齡成蜂時耗氧量達最大，為0.0344 mL/min，顯著高于其他時期的耗氧量(P<0.05)。與健康意蜂不同，染螨意蜂工蜂耗氧量變化曲線為先升后降，其中5日齡蛹期耗氧量最高，達0.0244 mL/min，顯著高于4日齡幼蟲、新出房成蜂和出房后6日齡成蜂的耗氧量(P<0.05)；隨后染螨新出房意蜂耗氧量迅速降低，至6日齡成蜂時耗氧量最低，為0.0093 mL/min，極顯著低于健康意蜂同日齡成蜂耗氧量(P<0.01)。

圖2 狄斯瓦螨感染的與健康的不同發育時期意蜂工蜂耗氧量的差異

2.2 染螨意蜂與健康意蜂工蜂CO2釋放量的比較分析

由圖3可知，健康意蜂CO2釋放量從4日齡幼蟲至6日齡成蜂呈逐漸上升趨勢，至6日齡成蜂時CO2釋放量達最大，為0.0316 mL/min，顯著高于其他時期CO2釋放量(P<0.05)。與健康意蜂不同，染螨意蜂CO2釋放量變化特征為先升后降，5日齡蛹期CO2釋放量最高，達0.0174 mL/min，顯著高于4日齡幼蟲、新出房成蜂和6日齡成蜂時期的CO2釋放量(P<0.05)；染螨意蜂的CO2釋放量以5日齡蛹期為拐點，5日齡蛹期至新出房成蜂的CO2釋放量迅速降低，低至0.0053 mL/min，極顯著低于同齡期健康意蜂CO2釋放量(P<0.01)；新出房成蜂與6日齡成蜂期比較，染螨意蜂CO2釋放量變化曲線下降較小，差異不顯著(P>0.05)。 與健康意蜂相比，染螨意蜂6日齡成蜂CO2釋放量極顯著降低(P<0.01)。

圖3 狄斯瓦螨感染的與健康的不同發育時期意蜂工蜂CO2釋放量的差異

2.3 染螨意蜂與健康意蜂工蜂呼吸商的比較分析

呼吸商(RQ)是CO2的釋放量和O2消耗量的比值，常用來判斷呼吸底物性質的指標。由表2可知，隨著意蜂的發育，健康意蜂呼吸商沒有明顯變化，總體呈平緩上升趨勢，雖然6日齡成蜂時呼吸商達最高，為0.9169，但與其他發育階段的呼吸商相比，差異不顯著(P>0.05)。與健康意蜂相比，染螨意蜂呼吸商呈下降變化趨勢，尤其是成蜂時期，呼吸商低于0.6，顯著低于健康意蜂(P<0.05)。

表2 狄斯瓦螨感染的與健康的不同發育時期意蜂工蜂的呼吸商

圖4 狄斯瓦螨感染的與健康意蜂成年工蜂呼吸代謝相關基因的相對表達量

2.4 狄斯瓦螨感染后意蜂成年工蜂呼吸代謝相關基因的表達分析

染螨成年工蜂與健康成年工蜂中Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt基因的相對表達量見圖4。結果發現，染螨成年工蜂中Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt基因的表達量均高于健康成年工蜂，且CytB和CytC的相對表達量分別是健康成年工蜂的1.7676和1.9929倍，差異達顯著水平(P<0.05)。

3 討論

昆蟲耗氧量、CO2釋放量的測定是研究其呼吸代謝功能的一種重要指標。狄斯瓦螨作為全世界意蜂蜂群最具毀滅性的害蟲之一，嚴重影響著意蜂生長、發育和代謝強度(秦瑤等, 2018)。研究表明，昆蟲在適宜環境內呼吸代謝平穩，處于最協調狀態；當受到外界壓力刺激時，呼吸代謝則出現大幅度變化，昆蟲可通過一系列生理活動(早熟化蛹)、生化反應(呼吸商變化、ATP變化等)或相應的應激反應來自我調節以適應外界壓力(Addo-Bediakoetal., 2002; Martinezetal., 2017)。本研究結果發現，意蜂受狄斯瓦螨侵染后，其耗氧量、CO2釋放量呈先升后降趨勢，其中耗氧量從5日齡蛹期的0.0244 mL/min下降至6日齡成蜂期的0.0093 mL/min，CO2釋放量從5日齡蛹期的0.0174 mL/min下降至6日齡成蜂期的0.0040 mL/min，在整個變化中可明顯看到一個拐點期，即意蜂5日齡蛹期的耗氧量和CO2釋放量達到最高，顯著高于健康意蜂(圖2和3)。這可能與狄斯瓦螨入侵宿主蛹期后導致其機體出現增強呼吸代謝的自我調節有關，由于狄斯瓦螨通常寄生于意蜂蛹發育時期，該時期最大的特點是面對外界生物侵襲時防御能力較低，此時期的蛹不需要攝取外界食物，因此蛹期的耗氧量和CO2釋放量達到最高，隨后隨著狄斯瓦螨侵染，意蜂呼吸代謝大幅下降。盡管不同外界因素對蜜蜂呼吸代謝影響的研究較多(Jungmannetal., 1989; 繆曉青等, 2001; 盧宜娟等, 2010)，但未見涉及有害生物因子如寄生蟲等對蜜蜂呼吸代謝影響的報道，本研究首次分析了受狄斯瓦螨侵染后意蜂呼吸代謝的變化規律，對今后指導蜂螨防治具有重要意義。

呼吸商作為判斷昆蟲代謝底物類型的重要指標，可直觀反映昆蟲在不同發育時期、不同環境狀態下所消耗的代謝底物種類。本研究發現，健康意蜂4日齡幼蟲呼吸商為0.8540，5日齡蛹呼吸商為0.7837，6日齡成蜂呼吸商為0.9169(表2)。前人研究發現，昆蟲的呼吸商可反映出代謝底物類型，呼吸商在0.71時，呼吸代謝底物為脂類，呼吸商在0.8時，呼吸代謝底物為蛋白質，呼吸商在1.0時，呼吸代謝底物為碳水化合物(吳坤君等, 1989)，根據前人的研究結果，可以推測正常發育意蜂幼蟲期呼吸代謝底物主要為蛋白質，蛹期主要為脂類，成蜂期主要為碳水化合物。這種推論與意蜂生長發育時的食物供給相一致。而受狄斯瓦螨侵染后，意蜂呼吸商劇烈下降，從5日齡蛹期的呼吸商0.7049下降至6日齡成蜂期的0.4424，顯著低于健康意蜂(表2)，這可能與意蜂受到外界脅迫后，可通過調節呼吸代謝水平的強弱、調整代謝底物的類型等方式來提高其對環境脅迫的適應能力有關。但隨著狄斯瓦螨侵染，一方面可促使DWV等病毒顯著增殖，導致意蜂體液免疫和細胞免疫等代謝水平發生紊亂，另一方面意蜂代謝底物的大量消耗及有毒代謝物的積累，可嚴重破壞意蜂正常代謝途徑，從而影響意蜂正常的生理生化代謝，這與Hatjina等(2013)、DeVries等(2015)、錢雪等(2016)、何立志等(2017)和閆蒙云等(2018)的研究結果相近，認為當受溫度、饑餓、殺蟲劑等因素脅迫下，昆蟲可通過改變代謝底物的類型來增強機體對不良因子的抵抗力。

研究表明，同一物種不同品種、相同品種不同狀態下的昆蟲其呼吸商也存在較大差異。Jungmann等(1989)研究表明，低溫下(Ta=10℃)休息的成蜂呼吸商為1.01，與高溫下(12.5℃≤Ta≤35℃)活動的成蜂呼吸商差異不顯著，長時間飛行的蜜蜂呼吸商顯著小于1.00。繆曉青等(2001)研究發現，中蜂工蜂蛹期呼吸商為0.798，意蜂工蜂蛹期呼吸商為0.846。盧宜娟等(2010)研究表明，中華蜜蜂幼蟲期呼吸商為0.838，意大利蜜蜂幼蟲期為0.870，中華蜜蜂蛹期呼吸商為0.760，意大利蜜蜂蛹期為0.770。與繆曉青(2001)和盧宜娟(2010)的研究比較發現，中華蜜蜂幼蟲期和蛹期的呼吸商均低于意蜂，動態范圍在0.7～0.9之間，染螨意蜂呼吸商均明顯低于健康意蜂呼吸商，染螨后呼吸商急劇下降低于0.5。因此，蜜蜂呼吸商低于0.5時，可作為科學評價其受外界危害程度的一個閾值。本實驗對染螨條件下參與意蜂呼吸代謝的5個侯選基因(Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt)的表達特性進行了初步研究。其中Coq7(也稱為mclk-1)是一種羥化酶(coq7p)，參與輔酶(CoQ)合成途徑的最后一步(Acostaetal., 2016)；核編碼線粒體翻譯起始因子2(IF-2mt)，是線粒體蛋白質合成的一種關鍵調節酶；線粒體編碼的細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COXⅠ)，是細胞色素C氧化酶(復合物Ⅳ)的催化亞單位之一，呼吸鏈的末端酶，可將電子從CytC上轉移到O2(Coronaetal., 2005)。細胞色素C存在于線粒體內膜上，作為呼吸鏈的重要一員，影響ATP的產生。細胞色素B(CytB)、細胞色素C(CytC)為生命體內氧化還原鏈上重要的電子傳遞體，在哺乳動物細胞中，細胞色素C從線粒體釋放到胞質中是起始凋亡途徑的關鍵一步，被認為是線粒體凋亡途徑的重要標志(Liuetal., 2007)。本研究發現，受狄斯瓦螨侵染后，意蜂成年工蜂中與呼吸相關侯選基因的表達量均高于健康成蜂(圖4)，這與前人的報道(Navarroetal., 2002)相似。意蜂從蛹期至成蜂期呼吸商降低，其與呼吸相關基因的表達卻明顯提高，其中CytB和CytC基因在染螨前后表達差異顯著(圖4)，推測受狄斯瓦螨侵染后，意蜂機體呼吸代謝受到較大影響，初期可通過調節呼吸和消耗代謝底物(脂類)進行適應性防御，但隨著代謝底物的大量消耗，最終導致染螨后意蜂成蜂代謝紊亂、壽命縮短，這與Bowen-Walker和Gunn(2001)和Ramsey等(2019)研究結果相似。

本研究僅對染螨條件下意蜂的呼吸代謝進行了初步研究，今后應進一步研究在狄斯瓦螨侵染過程中，與意蜂呼吸相關基因所涉及代謝途徑的調控機制，以及蜜蜂機體在適應調節及應激條件下，與呼吸代謝相關因子表達規律及細胞傳導途徑，對今后開展蜜蜂與寄生螨之間的互作研究奠定基礎，為有效防控螨害提供依據。