小菜蛾保幼激素受體PxMet-1和PxMet-2的原核表達、純化及與保幼激素的結合模式

彭 露, 秦玉冬, 鄒明民, 董詩杰,劉莉莉, 尤民生,*

(1. 福建農林大學, 閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室, 福州 350002; 2. 福建農林大學應用生態研究所, 福州 350002;3. 福建農林大學, 教育部害蟲生態防控國際合作聯合實驗室, 福州 350002;4. 福建農林大學, 福建省昆蟲生態重點實驗室, 福州 350002)

小菜蛾Plutellaxylostella屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是世界性的遷飛害蟲，主要危害十字花科植物，如蘿卜、薹菜、油菜、椰菜等(Ahujaetal., 2010)。研究證實，小菜蛾每年在全球范圍內造成的損失和防治費約為40～50億美元(Zaluckietal., 2012; Furlongetal., 2013)，而每年在我國造成的損失和防治費則高達7億美元(Lietal., 2016)。在生產上人們采用了包括化學防治和生物防治在內的各種防控方法，但效果仍不明顯。因此，尋求快速有效的控制小菜蛾危害的新方法亟不可待。

保幼激素(juvenile hormone, JH)作為一種親脂性的倍半萜類激素(R?ller and Dahm, 1967)，控制著昆蟲各個生長發育階段，對昆蟲發育變態的轉換起著重要作用，能直接作用于昆蟲生殖發育過程(Wyatt and Davey, 1996; Feietal., 2005)，也參與了昆蟲其他生理活動，如遷飛、營養利用、表型變化以及級型分化等(Sunetal., 2013; Xuetal., 2013; Mirthetal., 2014)。雖然JH是調控昆蟲生理過程最為重要的激素之一，但對其分子調控機制的研究仍然相對匱乏，主要受制于JH核受體的鑒定(周樹堂等, 2012)。近年來，越來越多的證據顯示，烯蟲酯耐性(methoprene-tolerant, Met)蛋白是JH的核受體(Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2013)。

Met屬于basic-helix-loop-helix (bHLH)/Per-Arnt-Sim (PAS)轉錄因子家族成員(Ashoketal., 1998)，包括一段堿性DNA結合域的氨基酸序列(basic region)、一個螺旋-環-螺旋結構(helix-loop-helix)、兩個空間可變的PAS結合域(PAS-A, PAS-B)和一個C末端(PAC)。已有研究表明，Met在昆蟲各個生理過程中具有重要作用，如控制昆蟲變態發育(Konopova and Jindra, 2007)與翅型分化(Lozano and Belles, 2014)，調控昆蟲卵巢發育、卵子形成、胚胎發育，產卵量以及交配行為等(Bilenetal., 2013; Guoetal., 2014; Marchaletal., 2014; Smykaletal., 2014; 彭露等, 2019)。Met通常以非共價形式與自身形成同質二聚體存在于真核細胞中，在果蠅中發現了第一個Met與Met，以及Met與其同源蛋白Gce形成的同質二聚體(Godlewskietal., 2006)。然而當JH存在時，Met形成的同質二聚體需要解離，與該家族其他成員聚合成異質二聚體，才能形成一個具有活性的轉錄因子，從而傳遞JH調控信號(Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2013)。不同種類昆蟲以及同種昆蟲中Met結合的bHLH-PAS家族成員類型可能并不相同，例如在家蠶Bombyxmori、蝗蟲與赤擬谷盜Triboliumcastaneum中，在JH信號作用下，Met可與同家族的steroid receptor co-activator(SRC)形成異質二聚體調控JH通路下游基因的表達，從而調節其變態發育或生殖過程(Zhangetal., 2011; Kayukawaetal., 2012; Guoetal., 2014)。然而，埃及伊蚊AedesaegyptiMet與FISC(Ftz-F1-interacting steroid receptor coactivator)形成二聚體復合物調控下游基因表達(Lietal., 2011, 2014)。Shin等(2012)還發現，在JH信號作用下，埃及伊蚊Met蛋白與bHLH-PAS家族的Cycle蛋白形成異質二聚體，與kr-h1基因啟動子上游的調控元件E-box-like基序結合，實現對kr-h1的表達調控，從而調節其生活節律。

迄今，對于Met蛋白的研究主要集中在模式昆蟲中，在小菜蛾中仍為空白。本研究對小菜蛾Met蛋白PxMet-1與PxMet-2進行了原核表達與純化，并利用分子對接技術解析了PxMet-1與PxMet-2與JH的結合模式，這將對篩選、鑒定及分析小菜蛾Met互作蛋白及其功能，深入闡明JH調控小菜蛾生殖發育的分子機理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及飼養

供試昆蟲為敏感品系小菜蛾，其原始種群于2004年采自福建省福州市晉安區新店鎮菜地(26.08°N, 119.28°E)，經過室內的長期連續繼代培養，期間不使用任何農藥，飼養環境為溫度25±1℃、相對濕度(RH)70%～80%、光周期 16L∶8D，羽化后的小菜蛾成蟲采用蜂蜜水喂養，并放在塑料瓶中進行交配產卵。孵化的小菜蛾幼蟲在生長一周的蘿卜Raphanussativus(福州立信種苗)苗上取食，蘿卜苗種在人工氣候室，室內溫度為 25±1℃，相對濕度約為75%，期間不使用任何農藥。

1.2 小菜蛾Met基因的克隆驗證

從NCBI數據庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載已經克隆鑒定的小菜蛾PxMet-1(GenBank登錄號: MK697672)和PxMet-2(GenBank登錄號: MK697673)開放閱讀框(ORF)全長序列(彭露等, 2019)，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，由尚亞生物技術(福州)有限公司合成。

選取5～8頭初羽化小菜蛾雌成蟲，置于滅菌后的2 mL離心管中，經過液氮處理后采用Promega的RNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μL產物用分光光度計測定RNA的濃度和質量，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性，把合格的RNA樣品置于-80℃超低溫冰箱凍存備用。提取的總RNA采用Vazyme公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒進行逆轉錄反應合成cDNA第1鏈，于-20℃保存備用。

以合成的cDNA為模板，使用Vazyme公司的Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶，分別以Met-1 F1/Met-1 R1和Met-2 F1/Met-2 R1為引物擴增PxMet-1基因序列和PxMet-2序列片段1； 隨后用PxMet-2序列片段1連接pJET1.2載體的質粒為模板，以Met-2 F2/Met-2 R1為引物擴增獲得PxMet-2序列片段2，最后用PxMet-2序列片段2連接pJET1.2載體的質粒為模板，以Met-2 F3/Met-2R1為引物擴增獲得全長PxMet-2基因序列(表1)。反應體系: 2×Phanta Max Buffer 12.5 μL, cDNA模板1 μL, dNTP Mix(10 mmol/L)0.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, Super-Fidelity DNA Polymerase(1 U/μL)0.5 μL, 最后用ddH2O補足25 μL。PCR反應程序: 98℃預變性5 min; 98℃變性30 s, 55℃(PxMet-1)/65℃(PxMet-2)分別退火30 s, 72℃分別延伸1.5 min(PxMet-1)/2 min(PxMet-2),共34個循環; 72℃延伸10 min。 反應結束后，取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V, 20 min)，利用試劑盒(OMEGA, 美國)純化回收目的片段，把膠回收的產物利用pJET1.2克隆載體(50 ng/μL)試劑盒進行連接，并轉化至50 μL大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態細胞(天根)，隨后接種至帶有氨芐抗生素的LB固體培養基中培養，37℃過夜培養，隨機挑取多個單克隆進行PCR驗證，鑒定陽性結果后送鉑尚生物技術(福州)有限公司測序。

表1 本研究所用引物

1.3 序列分析與系統進化樹構建

通過SnapGene對測序獲得的序列與NCBI上小菜蛾Met進行比對；利用Expasy(https:∥web.expasy.org/cgi-bin/translate/dna2aa.cgi)預測開放閱讀框；應用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)鑒定PxMet-1和PxMet-2蛋白的保守結構域；通過同源建模的SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)和穿線法的I-TASSER(https:∥zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)構建蛋白三維模型。

1.4 PxMet-1和PxMet-2蛋白的原核表達

利用克隆獲得的PxMet-1和PxMet-2全長序列，設計帶有EcoR I和SacI酶切位點的PxMet-1特異性引物和帶有XhoI和Hind III酶切位點的PxMet-2特異性引物(表1)，并在下游引物末端加上His標簽。利用Met-1-EcoRI F/Met-1-SacI R和Met-2-Xho I F/Met-2-Hind III R引物(表1)，以pJET1.2-PxMet-1和pJET1.2-PxMet-2質粒為模板進行PCR擴增，反應體系和程序同1.2節。用對應的限制性內切酶酶切后回收，連接至pGEX-KG載體，把上述的連接產物pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2分別轉化到大腸桿菌BL21(DE3)表達感受態細胞中，進行菌落PCR，以菌液為模板，用通用引物T7-F和T7-R(表1)進行菌液PCR驗證。取含有重組質粒的保存菌液，按1%的接種量接種到新鮮的含有50 μg/mL Amp的LB液體培養基中37℃過夜活化；取活化菌液按1∶100比例加入到1 000 mL的上述培養基中，保持37℃，待OD600=0.6～0.8時加入不同濃度的IPTG進行誘導表達(PxMet-1: 0.3 mmol/L IPTG在16℃下誘導16 h; PxMet-2: 0.1 mmol/L IPTG在16℃下誘導16 h)。重組菌體經超聲波破碎后(新芝超聲破碎儀，頻率200 Hz，超聲破碎2 s，間歇4 s，總時間30 min), 4℃, 14 000 r/min, 30 min離心分別收集上清和沉淀。10% SDS-PAGE檢測融合蛋白。

1.5 PxMet-1和PxMet-2融合蛋白的純化與鑒定

使用AKTA pure 25蛋白純化系統，并選擇His和GST 標簽進行純化。pGEX-KG-PxMet-1與pGEX-KG-PxMet-2純化分別使用His TrapTMHP 5 mL(GE Healthcare，美國)與GST TrapTMHP 5 mL(GE Healthcare，美國)柱子純化。分別使用咪唑溶液(濃度梯度為0, 20, 150和500 mmol/L)和還原型谷胱甘肽溶液(20 mmol/L)洗脫PxMet-1與PxMet-2融合蛋白。洗脫出的PxMet-1與PxMet-2融合蛋白分別用30與50 kD的超濾管濃縮脫鹽(Millipore，美國)。最后對純化的蛋白進行SDS-PAGE檢測和Western blot驗證，Western blot驗證分別使用His和GST標簽蛋白抗體，純化的蛋白用Solarbio的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定融合蛋白濃度。

1.6 PxMet-1和PxMet-2與保幼激素的結合模式分析

把PxMet-1和PxMet-2序列放到在線同源建模網站預測，找到相似度最高的同源模板PDB，利用該模板到薛定諤軟件中進行同源建模(Jacobsonetal., 2004)，在ChemDraw軟件中畫出JH I, JH II和JH III 3種保幼激素的結構式，把其結構式小分子文件放到薛定諤軟件中與構建的蛋白模型進行分子對接(Linetal., 2018)。參考已報道的赤擬谷盜Met與JH結合位點(Charlesetal., 2011)，利用軟件預測PxMet的分子對接口袋。

2 結果

2.1 PxMet-1和PxMet-2克隆驗證

PCR克隆驗證結果顯示，克隆獲得的PxMet-1和PxMet-2全長cDNA序列分別為1 575和2 100 bp(圖1)，與NBCI數據庫記載的序列長度一致。比對分析顯示，PxMet-1測序結果與原序列核苷酸一致性為100%，PxMet-2(GenBank登錄號: MT996234)測序結果與原序列存在1個非同義突變，突變位點為第41位氨基酸，由甘氨酸(Gly)突變為丙氨酸(Ala)(圖2)，核苷酸序列一致性為99.9%。

2.2 PxMet-1和PxMet-2的三維結構

從SWISS-MODEL和I-TASSER預測的三維結構(圖2)可以看出兩種方法預測出的蛋白模型結構都相似，且PxMet-1與PxMet-2蛋白都包含典型的螺旋-環-螺旋結構(helix-loop-helix)。

圖1 小菜蛾PxMet-1(A)和PxMet-2(B)基因克隆

圖2 小菜蛾Met蛋白三級結構預測

2.3 PxMet-1和PxMet-2的原核表達

菌液PCR檢測結果顯示，構建的pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2重組質粒均獲得預期大小的條帶，陽性克隆子測序結果也與構建的重組載體序列一致(圖3)。

pGEX-KG-PxMet-1表達產物成熟肽部分的核苷酸序列含有2 325個堿基，編碼774個氨基酸，記作PxMet-1融合蛋白，預測分子質量為89.2 kD；pGEX-KG-PxMet-2表達產物成熟肽部分的核苷酸序列含有2 859個堿基，編碼952個氨基酸，記作PxMet-2融合蛋白，預測分子質量為106 kD；兩個融合蛋白均包括GST和His標簽蛋白。不同條件的誘導表達，結果顯示，PxMet-1與PxMet-2融合蛋白分別在0.3和0.1 mmol/L IPTG 16℃誘導16 h表達量最高。SDS-PAGE電泳結果顯示，pGEX-KG-PxMet-1與對照(pGEX-KG)相比在89.2 kD處多一條條帶，且與PxMet-1融合蛋白大小一致；而pGEX-KG-PxMet-2與對照相比在106 kD處多一條條帶，且與PxMet-2融合蛋白大小一致，表明構建的原核表達系統可以實現PxMet-1與PxMet-2融合蛋白的原核表達(圖4: A)。

把收集的菌體用超聲波破碎后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE表達檢測，結果顯示，上清和沉淀中均檢測到對應大小的PxMet-1與PxMet-2融合蛋白條帶(圖4: B)，說明兩種蛋白在上清和沉淀中都有表達。我們選擇上清中的蛋白進行純化分析。

圖3 重組質粒pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2轉化大腸桿菌BL21菌液PCR

圖4 小菜蛾融合蛋白PxMet-1和PxMet-2的誘導表達

2.4 PxMet-1和PxMet-2融合蛋白的純化

PxMet-1融合蛋白使用HisTrapTMHP 5 mL柱子進行純化，結果表明，不同濃度咪唑都能把PxMet-1融合蛋白洗脫下來，其中在150 mmol/L咪唑濃度下，被洗脫下來的融合蛋白純度最高(圖5: A)。PxMet-2融合蛋白使用GSTTrapTMHP 5 mL柱子進行親和層析，結果顯示，使用20 mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫時，被洗脫下來的融合蛋白純度最高(圖5: B)。

圖5 小菜蛾PxMet-1(A)和PxMet-2 (B)融合蛋白純化的SDS-PAGE檢測

2.5 PxMet-1和PxMet-2融合蛋白的鑒定

純化的融合蛋白進行SDS-PAGE檢測和Western blot驗證。SDS-PAGE結果顯示，PxMet-1和PxMet-2分別純化獲得單一的目的蛋白條帶，條帶大小與預期的結果相符(圖6: A, B)；Western blot結果顯示PxMet-1和PxMet-2融合蛋白分別在89.2與106 kD位置獲得條帶(圖6: C, D)，表明純化獲得的蛋白為PxMet-1和PxMet-2的融合蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，純化的蛋白濃度都大于1 mg/mL。

圖6 小菜蛾PxMet-1和PxMet-2融合蛋白SDS-PAGE (A, B)和Western blot (C, D)驗證

2.6 PxMet-1和PxMet-2與JH的結合模式

分子對接口袋預測結果顯示，PxMet-1與PxMet-2的分子對接口袋分別為: PxMet-1: 341Phe, 307Thr, 309His, 350Val, 354Leu和333Val; PxMet-2: 358Leu, 354Val, 311Thr, 313His, 392Thr, 337Val和345Phe。

隨后我們選擇了常見的JH I, JH II和JH III 3種分子與PxMet-1和PxMet-2分別進行分子對接。對接分數反映了小分子和靶標蛋白結合的強弱。結果顯示，PxMet-1和PxMet-2與3種JH分子都存在結合作用，其中PxMet-1與JH II結合作用最強，結合分數為-10.746，而PxMet-2與JH I結合作用最強，其結合分數為-9.469。分子對接分析結果還顯示，為PxMet-1和PxMet-2與JH存在相互作用位點(如圖7和8中紫色箭頭所示)，所有位點均在對接口袋內，且位于PAS-B保守結構域，與已報道的赤擬谷盜Met與JH結合位點(Charlesetal., 2011)相同，推測PxMet蛋白同樣也是小菜蛾JH分子的作用受體。

圖7 分子對接分析小菜蛾PxMet-1與JH的結合模式

圖8 分子對接分析小菜蛾PxMet-2與JH的結合模式

3 討論

本研究通過克隆驗證小菜蛾PxMet-1和PxMet-2基因，與NCBI數據庫記載的序列相比對(彭露等, 2019)，PxMet-1與原記載序列的核苷酸序列一致性為100%，PxMet-2僅在第41位氨基酸由Gly突變為Ala，與原記載序列的核苷酸序列一致性高達99.9%，說明我們獲得的序列信息準確，可用于后續的載體構建。蛋白結構分析顯示，PxMet-1和PxMet-2與其他已知昆蟲Met蛋白一致，都具有該家族的保守結構域(Konopova and Jindra, 2007; Lietal., 2011; Suetsuguetal., 2013; Linetal., 2015)，表明小菜蛾Met基因在進化過程較為保守。其中，bHLH結構域主要是真核生物的轉錄因子，具有與DNA結合的作用，并在生物的一系列生理過程中發揮著決定性作用；PAS蛋白主要參與K+通道信號傳遞，PAS結構域是一個信號敏感域，可以促進PAS蛋白之間或與其他核受體蛋白的相互作用，PAC結構域則與PAS結構域的折疊有關(Ashoketal., 1998; Miuraetal., 2005; Jindraetal., 2013)，由此我們推測小菜蛾Met基因與其家族其他成員一樣主要在轉錄調節中發揮作用。同時利用SWISS-MODEL與I-TASSER構建蛋白模型，結果顯示，這兩種方法構建的PxMet蛋白模型結構相似，都包含典型的螺旋-環-螺旋結構，說明我們構建的蛋白模型可信度較高，可以用于后續的蛋白結構與結合特性分析(Linetal., 2018)。

本研究構建了PxMet-1和PxMet-2蛋白的原核表達載體pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2，并轉至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞表達菌株，PxMet-1與PxMet-2分別通過0.3與0.1 mmol/L IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳結果顯示，pGEX-KG-PxMet-1和pGEX-KG-PxMet-2分別在89.2與106 kD 處產生特異性條帶，且符合推測大小，表明PxMet-1與PxMet-2融合蛋白已被成功表達，且在上清和沉淀中都有表達。最后分別利用HisTrapTMHP與GSTTrapTMHP柱親和層析純化獲得高純度PxMet-1與PxMet-2融合蛋白，為進一步的互作蛋白篩選與功能研究奠定了基礎。

在PxMet與JH的結合模式分析過程中，我們選擇了常見的JH I, JH II和JH III進行分子對接分析。我們發現，Met蛋白通過PAS-B結構域形成具有較高親和力的口袋型來結合JH，這與其他的研究結果(Miuraetal., 2005; Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2013)較一致，也與PAS結構域可以促進PAS蛋白之間或與其他核受體蛋白的相互作用結論一致，由此我們推測，PxMet-1與PxMet-2蛋白同樣也是小菜蛾JH分子的作用受體。前期研究證實，PxMet-1與PxMet-2具有齡期表達偏好性，PxMet-1與PxMet-2分別在蛹期與成蟲期相對高表達(彭露等, 2019)。Jindra等(2013)表明，JHⅠ和JHⅡ是鱗翅目特有的，幼蟲咽側體只分泌這兩種化合物，而成年雌性咽側體除了產生JHⅠ和JHⅡ外還產生JHⅢ。我們的研究發現，PxMet-1與JH II結合作用最強，PxMet-2與JHⅢ結合作用最強，說明PxMet-1與PxMet-2作用的時期，以及分子機制并不相同。

本研究進一步克隆驗證了小菜蛾Met基因PxMet-1和PxMet-2的全長序列，解析了PxMet-1和PxMet-2的三維結構，并完成了PxMet-1和PxMet-2的原核表達與純化，最后分析了PxMet-1和PxMet-2與JH的結合模式，為闡明JH調控小菜蛾發育與生殖過程的分子信號途徑提供了初步的依據。PxMet-1與 PxMet-2的互作蛋白篩選，以及它們介導的分子調控機制仍有待我們進一步研究。