人乳頭瘤病毒基因亞型與宮頸病變的相關(guān)性及臨床意義分析

陳彩霞

湖北省十堰市鄖陽區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 442500

女性常見惡性腫瘤當(dāng)中發(fā)病率位居第二的就是宮頸癌，位居首位的是乳腺癌[1]。世衛(wèi)組織報(bào)道指出，每年的發(fā)病數(shù)量有約50萬；而在中國每年宮頸癌的新發(fā)病例約14萬，對(duì)女性的生活及生命質(zhì)量都產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[2]。隨著臨床研究的不斷深入，人乳頭瘤病毒(HPV)開始逐漸進(jìn)入到臨床對(duì)宮頸癌的研究中，且經(jīng)過近幾年研究指出，感染HPV是導(dǎo)致女性出現(xiàn)宮頸病變的一項(xiàng)主要原因[3]。目前臨床中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的HPV基因亞型大概有100多個(gè)，其中，跟人類生殖道相關(guān)疾病有聯(lián)系的約40多個(gè)[4]。依據(jù)HPV基因亞型的不同致病能力，其主要分為低危型和高危型。感染HPV跟機(jī)體免疫功能、性活躍程度及年齡都存在十分密切的聯(lián)系。本研究采用PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)HPV的基因亞型，探討宮頸病變與HPV不同亞型之間的關(guān)系，為宮頸疾病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1—12月我院婦科864例宮頸病變患者為觀察對(duì)象，患者年齡18～60歲，平均年齡(38.6±1.3)歲。所有患者經(jīng)過HPV檢測(cè)和宮頸病理活檢。

1.2 儀器與試劑 PCR 擴(kuò)增儀：羅氏480全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。分子雜交儀：深圳亞能Combi-H12分子雜交儀。HPV基因分型檢測(cè)試劑盒：深圳亞能生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HPV-DNA標(biāo)本的采集：以專用宮頸脫落細(xì)胞采集器進(jìn)行采集，醫(yī)護(hù)人員先以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去，取出宮頸刷置于宮頸口，單向旋轉(zhuǎn)4～5周以獲得足量的上皮細(xì)胞樣本，然后將宮頸刷頭部放入洗脫管中，沿刷柄折斷，旋緊洗脫管蓋，做好標(biāo)識(shí)并直立放置。統(tǒng)一送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 HPV-DNA的提取：充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干，取1ml洗脫液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，13 000r/min，離心10min，棄去上清液，保留管底的細(xì)胞沉淀。加入50μl裂解液懸浮沉淀，沸水浴加熱10min。13 000r/min，離心10min，保留上清液待用。

1.3.3 PCR擴(kuò)增：取出PCR反應(yīng)管，在管蓋上做好標(biāo)記，低速離心數(shù)秒，分別加入已提取的待測(cè)樣本DNA 5μl，反應(yīng)總體積為25μl(可加入1滴礦物油防止蒸發(fā))，低速離心數(shù)秒。每次實(shí)驗(yàn)可設(shè)置一個(gè)陰性質(zhì)控和一個(gè)陽性質(zhì)控，作為產(chǎn)品使用的質(zhì)量控制。PCR按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50℃ 15 min；95℃ 10 min；然后以94℃ 30s；42℃ 90s；72℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

1.3.4 雜交：取15ml塑料離心管，放入標(biāo)有樣本標(biāo)號(hào)的膜條(應(yīng)在膜條處用中性筆標(biāo)記)，加入A液5～6ml及所有(25μl)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將離心管放入沸水加熱10min(確保A液液面完全位于沸水液面以下)，取出再放入雜交箱51℃雜交至少1.5h。取出50ml塑料離心管，加入50ml B液，于雜交箱或水浴箱中預(yù)熱至51℃。陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品同步處理。

1.3.5 洗膜：取出膜條，移至裝有B液的50ml離心管中，于51℃輕搖洗滌5min。

1.3.6 顯色及HPV結(jié)果判定：按照HPV-DNA檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行雜交顯色，顯色結(jié)果按照說明書進(jìn)行判斷。膜條上探針按照規(guī)定序列排列，由藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)位置可判斷HPV的亞型。其中高危型18種包括HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，83，MM4。低危型5種包括HPV6，11，42，43，44。感染HPV:一種HPV-DNA亞型出現(xiàn)陽性；多重感染：兩種及兩種以上HPV-DNA亞型出現(xiàn)陽性。

1.3.7 宮頸組織病理活檢：正常或炎癥：樣本檢測(cè)結(jié)果提示僅存在炎癥或者正常；CINⅠ：輕度不典型增生；CINⅡ：中度不典型增生；CINⅢ：重度不典型增生；宮頸癌[5]。

1.4 觀察指標(biāo) (1)觀察所有人群的宮頸活檢結(jié)果及HPV陽性檢出比率。(2)觀察不同宮頸病變當(dāng)中的HPV常見基因亞型的分布情況。(3)觀察不同宮頸病變當(dāng)中單一HPV基因亞型感染及多重HPV基因亞型感染情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 所有人群的宮頸活檢結(jié)果及HPV陽性檢出比率 864例當(dāng)中，正常或炎癥宮頸：620例，CINⅠ：58例，CINⅡ：36例，CINⅢ：88例，宮頸癌：62例。HPV陽性比率隨著宮頸病變程度的不斷加重而升高(P<0.05)，具體見表1。

表1 所有人群的宮頸活檢結(jié)果及HPV陽性檢出比率

2.2 不同宮頸病變當(dāng)中的HPV常見基因亞型的分布情況 不同類型的宮頸病變當(dāng)中，HPV基因分型感染情況各不相同，前三位HPV基因?yàn)椋篊INⅠ：HPV-16型、HPV-33型、HPV-18型；CINⅡ：HPV-16型、HPV-18型；CIN Ⅲ：HPV-16型、HPV-58型、HPV-33型；宮頸癌：HPV-16型、HPV-33型、HPV-52型。

HPV常見亞型在不同宮頸病變當(dāng)中的感染情況：HPV-l6型在正常或炎癥當(dāng)中的檢出率為10.0%、在CINⅠ當(dāng)中的檢出率為13.8%，CINⅡ當(dāng)中的檢出率為38.9%，CINⅢ當(dāng)中的檢出率為34.1%，在宮頸癌當(dāng)中的檢出率為77.4%。HPV-52型在不同宮頸病變當(dāng)中的感染分別為：正常或炎癥：2.6%、CINⅠ：0%、CINⅡ：0%、CINⅢ：4.5%、宮頸癌：6.5%。HPV-58型在不同宮頸病變當(dāng)中的感染分別為：正常或炎癥：1.3%、CINⅠ：0%、CINⅡ：5.6%、CINⅢ：13.6%、宮頸癌：0%。

伴隨病情的不斷發(fā)展，HPV-16型在不同宮頸病變當(dāng)中的感染比率逐漸升高，在宮頸癌患者當(dāng)中同樣也是HPV-16型的比率優(yōu)勢(shì)顯著，為77.4%(48/62)，具體見表2。

表2 不同宮頸病變當(dāng)中的HPV常見基因亞型的分布情況

2.3 不同宮頸病變當(dāng)中單一HPV基因亞型感染及多重HPV基因亞型感染情況 宮頸癌當(dāng)中的HPV多重感染占比明顯更少，在宮頸癌當(dāng)中更多的是單一HPV基因型感染，且感染類型全部為高危分型，表示宮頸癌的一個(gè)顯著特點(diǎn)為高危型單一HPV感染，具體見表3。

表3 不同宮頸病變當(dāng)中單一HPV基因亞型感染及多重HPV基因亞型感染情況[n(%)]

3 討論

目前臨床當(dāng)中已經(jīng)充分明確了宮頸癌跟HPV之間的關(guān)系。HPV在早期的復(fù)制及表達(dá)時(shí)會(huì)出現(xiàn)E6癌蛋白和E7癌蛋白；而在HPV晚期時(shí)則會(huì)出現(xiàn)衣鞘蛋白Ll和衣鞘蛋白L2[6]。假如機(jī)體持續(xù)性的感染HPV，在早期時(shí)出現(xiàn)表達(dá)的E6癌蛋白就會(huì)使得p53分解水平顯著增加，進(jìn)而使得宮頸細(xì)胞所具有的特異性也明顯增加。E7癌蛋白會(huì)對(duì)E2F/pRb這一復(fù)合物產(chǎn)生干擾作用，主要作用是使得擁有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子E2F能夠被激活，導(dǎo)致發(fā)生翻譯異常及HPV轉(zhuǎn)錄[7]。當(dāng)損傷DNA時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致宮頸病變持續(xù)加重。本次研究結(jié)果提示，HPV陽性比率隨著宮頸病變程度的不斷加重而升高(P<0.05)。而在宮頸癌當(dāng)中HPV的陽性比率更是高至90.3%，這與類似研究結(jié)果一致。

本次研究結(jié)果提示，不同類型的宮頸病變當(dāng)中，HPV基因分型感染情況各不相同。研究結(jié)果提示，不同亞型的高危HPV基因其潛在的致病能力也各不相同，同時(shí)也反映了在不同宮頸病變當(dāng)中的流行性特征。在相關(guān)研究當(dāng)中指出，宮頸癌及CIN當(dāng)中最常見的一種HPV基因亞型就是高危型HPV-16型，這與本次研究結(jié)果一致[8]。本次研究結(jié)果提示，在宮頸癌患者當(dāng)中同樣也是HPV-16型的比率優(yōu)勢(shì)顯著，為77.4%(48/62)。相關(guān)研究指出，連續(xù)性的感染同一高危型HPV基因而導(dǎo)致的持續(xù)性感染，引發(fā)宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)最大。還有研究指出，針對(duì)常見的幾種高危型HPV基因亞型：HPV-16型、HPV-18型、HPV-31型、HPV-33型實(shí)施動(dòng)態(tài)持續(xù)性的檢測(cè)，結(jié)果提示，HPV-16型與其他HPV基因亞型相比所展現(xiàn)出的持續(xù)性感染更加明顯[9]。本次研究結(jié)果提示，伴隨病情的不斷發(fā)展，HPV-l6型在不同宮頸病變當(dāng)中的感染比率逐漸升高。分析其原因可能為HPV-16型更加容易導(dǎo)致發(fā)生持續(xù)性的感染，且機(jī)體很難將其進(jìn)行清除[10]，且HPV-16型是研究當(dāng)中最常見的一種宮頸癌HPV基因亞型，一定要引起臨床的重視及關(guān)注。

綜上所述，隨著宮頸病變程度的不斷加重，HPV的陽性比率也隨之逐漸升高；宮頸癌當(dāng)中的HPV基因亞型主要包括：HPV-16型、HPV-58型、HPV-18型。