vaspin、11β-HSD和IL-6在妊娠期糖尿病患者胎盤(pán)組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃 娟

香港大學(xué)深圳醫(yī)院,廣東省深圳市 518000

妊娠期糖耐量異常表現(xiàn)為胰島素抵抗(IR)和糖代謝異常[1]。vaspin是一種新胰島素增敏脂肪細(xì)胞因子，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。近來(lái)相關(guān)研究認(rèn)為其與T2DM存在一定的關(guān)系[2]。11β-HSD是參與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)預(yù)調(diào)節(jié)的重要代謝酶，其至少包括兩種亞型：11β-HSD1和11β-HSD2[3]。在體外培養(yǎng)中，IL-6上調(diào)了脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素的表達(dá)，但抑制了其在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(前脂肪)(3T3-L1細(xì)胞)中的表達(dá)，提示IL-6可能對(duì)脂肪細(xì)胞因子起調(diào)節(jié)作用[4]。本文研究對(duì)vaspin、11β-HSD和IL-6在妊娠期糖尿病患者胎盤(pán)組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，并探討了上述三者的相關(guān)性，旨在為臨床提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年1—6月于我院產(chǎn)科行擇期剖宮產(chǎn)的40例孕婦作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)擇期剖宮產(chǎn)(非急診因素剖宮產(chǎn)，如順產(chǎn)中轉(zhuǎn)剖宮產(chǎn)等，盡量減少宮內(nèi)感染因素)；(2)術(shù)中見(jiàn)羊水清(排除羊水糞染)；(3)排除合并各個(gè)系統(tǒng)的感染性疾病，比如呼吸系統(tǒng)感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染等；(4)孕婦簽字已放棄胎盤(pán)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)血糖控制不達(dá)標(biāo)，或有酮癥、酮癥酸中毒病史；(2)合并高血壓、肝腎功能異常、多囊卵巢綜合征、胎膜早破等；(3)妊娠前有糖尿病史。按孕婦有無(wú)GDM分為GDM組(20例)和非GDM組(20例)。GDM組早孕期血糖正常，孕24～28周 75g糖OGTT結(jié)果符合國(guó)際糖尿病研究協(xié)會(huì)制定的GDM標(biāo)準(zhǔn)，平均分娩孕周為(38.8±0.8)周，平均年齡為(32.0±3.4)歲；非GDM組早孕期血糖正常，孕24～28周， 75g糖OGTT提示陰性，分娩平均孕周為(39.2±0.7)周，平均年齡為(33.3±4.3)歲。 兩組孕婦的一般資料比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 vaspin、11β-HSD及IL-6的測(cè)定

1.2.1 標(biāo)本收集及處理：胎盤(pán)娩出后，在無(wú)菌操作下，從胎盤(pán)母體面中央位置取1.0cm組織方塊，用0.9%氯化鈉水溶液將其沖洗后置于EP管中，快速移至裝有液氮的冰壺中，置于-80℃冰箱儲(chǔ)存待檢。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法：檢測(cè)胎盤(pán)組織中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2及IL-6 mRNA表達(dá):(1)按總RNA提取試劑盒[購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]說(shuō)明書(shū)提取胎盤(pán)組織的總RNA，并鑒定其純度和濃度。(2)按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)合成RNA的互補(bǔ)DNA:反應(yīng)體系10μl。反應(yīng)條件:37℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15min,再85℃5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。(3)按美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)因子的NM序列號(hào)，設(shè)計(jì)合成引物，引物均由美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)合成。本次實(shí)施熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)引進(jìn)內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。引物序列見(jiàn)表1。(4)PCR反應(yīng)體系:嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，2×UltraSYBR Mixture(With ROX)10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDN A 8μl。(5)結(jié)果分析，以GAPDH作為內(nèi)參，采用京科瑞達(dá)ABI7900熒光定量PCR儀計(jì)算vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2、IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 BeWo細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞中vaspin含量測(cè)定 BeWo細(xì)胞購(gòu)自譽(yù)弛(上海)生物科技有限公司，采用F-12K培養(yǎng)液，含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在37℃、5%CO2、飽和濕度、pH 7.4孵育箱培養(yǎng)BeWo細(xì)胞，0.25%胰酶消化傳代，每3d換液傳代。接種BeWo細(xì)胞于六孔板中，1×106/孔，分別加入1、5、10ng/ml的IL-6，設(shè)置空白組。分別對(duì)不同濃度的IL-6設(shè)定時(shí)間梯度為12h、24h、48h、72h。收集不同濃度和時(shí)間的IL-6細(xì)胞，置于-80℃冰箱冷凍保存。用RT-PCR法分別測(cè)定細(xì)胞中vaspin含量，用有效作用濃度的IL-6作用BeWo細(xì)胞48h后，采用Western免疫印跡(WesternBlot)對(duì)細(xì)胞中vaspin蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.4 A549細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞上清液中IL-6含量測(cè)定 將4×105個(gè)A549細(xì)胞鋪于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于含體積分?jǐn)?shù)為0.01胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基中，37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h后按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體用量分別為6μl，重組質(zhì)粒用量為3μg，用無(wú)血清和抗生素的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后5h換成有血清和抗生素的培養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染后48h收取的細(xì)胞上清嚴(yán)格按EIISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-6含量。

2 結(jié)果

2.1 兩組胎盤(pán)組織中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2及IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 兩組胎盤(pán)組織vaspin mRNA及蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GDM組IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于非GDM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GDM組胎盤(pán)11β-HSD1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯低于非GDM組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；11β-HSD2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于非GDM組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組胎盤(pán)組織中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2 及IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

2.2 IL-6對(duì)BeWo細(xì)胞vaspin表達(dá)的影響 不同濃度的IL-6(1、5、10ng/ml)對(duì)BeWo細(xì)胞vaspin mRNA表達(dá)有抑制作用，10ng/ml濃度作用最明顯；10ng/ml IL-6在12、24、48、72h均可抑制BeWo細(xì)胞vaspin mRNA的表達(dá)，48h效果最明顯，蛋白表達(dá)也顯著降低，見(jiàn)圖1。

圖110ng/mlIL-6分別作用BeWo細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)

BeWo細(xì)胞中vaspinmRNA表達(dá)的影響

2.3 11β-HSD1、11β-HSD2重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè) 將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，His抗體在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞中可檢測(cè)到11β-HSD1和11β-HSD2的表達(dá)，而空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒(méi)有靶蛋白。轉(zhuǎn)染空載體和未經(jīng)處理的細(xì)胞上清液中IL-6水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)；轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞上清液中IL-6的水平低于轉(zhuǎn)染11β-HSD2重組質(zhì)粒的細(xì)胞上清液中IL-6的水平(P<0.05)，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞上清液IL-6水平高于轉(zhuǎn)染11β-HSD1重組質(zhì)粒的細(xì)胞上清液中IL-6的水平(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2ELISA測(cè)定細(xì)胞上清中的IL-6表達(dá)水平

3 討論

GDM可引起子癇前期、巨大兒、肩難產(chǎn)、新生兒濕肺、新生兒高膽紅素血癥等母嬰并發(fā)癥，嚴(yán)重影響母嬰健康和生命安全。當(dāng)前，GDM的發(fā)病機(jī)制與IR存在一定的關(guān)系。vaspin是一種新的胰島素增敏脂肪細(xì)胞因子，與IR存在緊密的關(guān)聯(lián)，近來(lái)有研究認(rèn)為其與T2DM的發(fā)生有關(guān)[5-6]。GDM患者vaspin水平存在差異的研究結(jié)果存在差異。本文研究結(jié)果顯示，GDM組胎盤(pán)組織vaspin表達(dá)水平與非GDM組比較，無(wú)顯著差異(P>0.05)。

IL-6是一種由T細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞合成的多功能細(xì)胞因子。是患者炎癥反應(yīng)十分關(guān)鍵的細(xì)胞因子。IL-6在GDM發(fā)病中的作用機(jī)制可能是：(1)抑制糖原合成酶，刺激肝糖原釋放，導(dǎo)致血糖升高；(2)誘導(dǎo)瘦素抵抗，并通過(guò)與瘦素共享信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低了對(duì)胰島素分泌的抑制作用；(3)通過(guò)肝細(xì)胞作用抑制胰島素受體底物-1(Insulin receptor substrate，IRSs-1)酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致IR。IL-6是GDM發(fā)病過(guò)程中十分關(guān)鍵的脂肪細(xì)胞因子[7-9]。本文研究顯示，GDM組IL-6表達(dá)水平高于非GDM組(P<0.05)。與相關(guān)研究結(jié)果一致。

本文研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的IL-6對(duì)BeWo細(xì)胞vaspin mRNA表達(dá)有抑制作用，10ng/ml濃度作用最明顯；10ng/ml IL-6在不同時(shí)間點(diǎn)均可抑制BeWo細(xì)胞vaspin mRNA的表達(dá)，48h效果最明顯，蛋白表達(dá)也顯著降低。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，GDM組孕中期血清vaspin略降低、而IL-6水平升高，vaspin與IL-6呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，因此認(rèn)為，脂肪細(xì)胞因子vaspin受炎癥因子IL-6的影響[8-10]。IL-6調(diào)節(jié)IR的機(jī)制尚未明確，當(dāng)前產(chǎn)生了兩種理論分歧：(1)IL-6升高可影響肝細(xì)胞IR，促進(jìn)全身性IR的發(fā)展。(2)體外研究顯示，在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和糖代謝負(fù)向調(diào)節(jié)過(guò)程中，IL-6是脂肪細(xì)胞的作用靶點(diǎn)[11-12]。

本文研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞上清與未處理的細(xì)胞上清相比IL-6水平無(wú)顯著差異(P>0.05);轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞上清IL-6水平低于轉(zhuǎn)染11β-HSD2重組質(zhì)粒的細(xì)胞上清IL-6水平(P<0.05)，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞上清IL-6水平高于轉(zhuǎn)染11β-HSD1重組質(zhì)粒的細(xì)胞上清IL-6水平(P<0.05)。11β-HSD對(duì)于調(diào)節(jié)GR前作用十分關(guān)鍵，其包括11β-HSD1和11β-HSD2兩個(gè)亞型，通常認(rèn)為11β-HSD1可提升GR濃度和活性，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受GR的炎性損傷，而11β-HSD2會(huì)降低GR濃度和活性，增大GR對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[13-14]。有研究結(jié)果顯示，在川崎病患兒急性期，11β-HSD1 mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，同時(shí)11β-HSD2 mRNA水平較對(duì)照組明顯降低，提示11β-HSD活性改變是川崎病急性期炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[15-17]。

綜上所述，GDM組與非GDM組vaspin mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異，IL-6可抑制BeWo細(xì)胞vaspin的表達(dá)，提示vaspin與炎癥存在一定的關(guān)系。GDM組11β-HSD1低表達(dá)，11β-HSD2高表達(dá)。它們與胰島素、脂質(zhì)代謝紊亂及胎盤(pán)炎癥反應(yīng)相關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步完善。