硫代乙酰胺所致急性肝損傷大鼠腸道菌群的變化

王春妍 曹宇 郭遠(yuǎn)強(qiáng) 趙黎莉 馮雪 文君 李嘉

肝衰竭為臨床常見的嚴(yán)重肝臟疾病，死亡率高。近年諸多研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)改變與肝衰竭發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。故此，本研究應(yīng)用硫代乙酰胺造成急性肝損傷大鼠模型，應(yīng)用高通量測(cè)序法分析急性肝損傷大鼠腸道菌群情況，了解大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、豐度與多樣性的變化。

資料與方法

一、材料

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SD雄性大鼠共16只，重230～250 g，清潔級(jí)，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。許可證號(hào)SCKK(京)2014-0004。

(二)實(shí)驗(yàn)試劑 硫代乙酰胺，購自天津市福晨化學(xué)試劑廠。

二、方法

(一)模型的制備及獲取 16只SD大鼠隨機(jī)分為造模組及正常對(duì)照組，造模組10只，對(duì)照組6只。予以皮下注射硫代乙酰胺(TAA)600 mg/kg造模急性肝損傷模型，正常對(duì)照組大鼠給予同等劑量生理鹽水皮注，48 h后造模完成。大鼠經(jīng)麻醉后，留取回腸糞便進(jìn)行腸道菌群16S rDNA測(cè)序分析。

(二)腸道菌群分析 處死大鼠后,留取回腸糞便,應(yīng)用糞便DNA提取試劑盒提取糞便細(xì)菌基因組DNA，利用引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)各個(gè)細(xì)菌的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。高通量測(cè)序文庫的構(gòu)建和基于 Illumina MiSeq 平臺(tái)的測(cè)序由 GENEWIZ 公司(蘇州, 中國)完成。應(yīng)用 Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA) 檢測(cè) DNA 樣品的濃度，使用 MetaVxTM文庫構(gòu)建試劑盒 (GENEWIZ, Inc., South Plainfield, NJ, USA)構(gòu)建測(cè)序文庫。

以30～50 ng DNA 為模板，使用金唯智設(shè)計(jì)的一系列 PCR 引物擴(kuò)增原核生物 16S rDNA 上包括 V3 及 V4 的 2 個(gè)高度可變區(qū)。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAA-TCC”序列的下游引物擴(kuò)增 V3 和 V4 區(qū)。另外，通過 PCR 向 16S rDNA 的 PCR 產(chǎn)物末端加上帶有 Index 的接頭，以便進(jìn)行 NGS 測(cè)序。 使用Agilent 2100 生物分析儀 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)檢測(cè)文庫質(zhì)量，并且通過 Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA)檢測(cè)文庫濃度。DNA 文庫混合后，按 Illumina MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)儀器使用說明書進(jìn)行 PE250/300 雙端測(cè)序(具體平臺(tái)以合同為準(zhǔn))，由 MiSeq 自帶的 MiSeq Control Software (MCS)讀取序列信息。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠一般狀態(tài)觀察

造模組大鼠48 h造模完成，死亡1只，其余大鼠處死前均有不同程度的精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食活動(dòng)減少及中毒性鼓腸。對(duì)照組大鼠進(jìn)食活動(dòng)正常，精神狀況好。

二、肝臟組織病理學(xué)結(jié)果

造模組大鼠肝組織呈灶狀及片狀壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝竇結(jié)構(gòu)破壞，急性肝損傷造模成功；對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝竇結(jié)構(gòu)清楚，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。

三、腸道細(xì)菌多樣性分析

通過ACE指數(shù)和 Chaol指數(shù)評(píng)估兩組樣本菌群豐度；通過Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)估兩組樣品菌群多樣性。結(jié)果顯示，造模組Chaol指數(shù)與對(duì)照組相比，有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)及ACE指數(shù)分析，結(jié)果顯示造模組上述指數(shù)與對(duì)照組相比有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

四、微生物群落結(jié)構(gòu)分析

(一)門分類等級(jí)細(xì)菌分布情況 在門水平上，兩組大鼠糞便中均有9個(gè)平均相對(duì)豐度都不低于1%的優(yōu)勢(shì)菌門：厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、疣微菌門、脫鐵桿菌門、軟皮菌類、細(xì)菌菌類及藍(lán)藻菌門。兩組的優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門，造模組中依次占61.25%、32.48%，對(duì)照組分別占72.50%、25.80%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其次豐度較高的門包括變形菌門、疣微菌門，造模組分別占2.91% 和2.73% ，對(duì)照組中分別占0.59%和0.63%。腸道菌群構(gòu)成差異分析，造模組變形菌門、疣微菌門菌群與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

(二)屬分類等級(jí)細(xì)菌分布情況 在屬水平上，造模組中豐度由高到低依次是：毛螺旋菌屬13.59%、擬桿菌屬10.74%、木虱科8.50%、阿克曼屬 2.74%，對(duì)照組豐度由高到低依次是：毛螺旋菌屬13.84%、乳桿菌屬13.55%、木虱科10.74%、反芻球菌科4.55%。腸道菌群構(gòu)成差異分析，造模組埃希菌屬、阿克曼屬、羅馬尼亞梭菌屬、真菌屬及嚴(yán)格梭菌屬豐度均高于對(duì)照組(P<0.05)，乳桿菌屬豐度低于對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

討 論

目前研究已證實(shí)腸道菌群與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。腸-肝軸在肝臟疾病治療中越來越受到重視[1]。

表1 腸道細(xì)菌多樣性分析

表2 門分類等級(jí)腸道菌群構(gòu)成差異分析

表3 屬分類等級(jí)腸道菌群構(gòu)成差異分析

本研究旨在應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)探討硫代乙酰胺所致急性肝損傷大鼠腸道菌群的變化。本研究證實(shí)，硫代乙酰胺可造成大鼠急性肝損傷模型。既往研究表明，硫代乙酰胺造成急性肝損傷模型，在急性肝損傷時(shí)出現(xiàn)明顯的腸道菌群失調(diào)[2]，但此研究所用的傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法存在一定局限性，故此本研究進(jìn)一步應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定腸道菌群全基因組，并對(duì)急性肝損傷大鼠腸道菌群的各菌種相對(duì)豐度、多樣性及菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行深度分析。

本研究選取了菌群富集的回腸，對(duì)大鼠腸道菌群16S V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。結(jié)果顯示造模組Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)及ACE指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，提示急性肝損傷組大鼠小腸菌群的豐度及多樣性均有升高，存在小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)[3]。小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)在肝臟疾病中廣泛存在，并與其嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4-5]。

本研究中，在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門兩者之和占90%以上，屬于優(yōu)勢(shì)菌群。厚壁菌門和擬桿菌門的比例被稱為F/B比率，可用于評(píng)估是否存在腸道菌群失調(diào)[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模組大鼠F/B比率低于對(duì)照組大鼠(P<0.05)，提示造模組大鼠存在腸道菌群紊亂。

變形菌門包含了諸多機(jī)會(huì)致病菌及病原菌，多為革蘭陰性桿菌，產(chǎn)生脂多糖，造成腸源性內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而加重肝臟損傷。本研究提示：造模組變形菌門、變形菌門中具有代表性的埃希菌屬，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示變形菌門在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定作用。

在屬水平上，腸道菌群構(gòu)成差異分析，造模組埃希菌屬、阿克曼屬、羅馬尼亞梭菌屬、真菌屬及嚴(yán)格梭菌屬豐度均高于對(duì)照組(P<0.05)，乳桿菌屬豐度低于對(duì)照組(P<0.05)，提示造模組大鼠腸道內(nèi)出現(xiàn)埃希菌屬增加及乳酸桿菌的消耗。埃希菌屬豐度增高，對(duì)黏膜的侵襲性增強(qiáng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并復(fù)制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，加重肝臟損傷。

研究表明，乳桿菌科可抑制腸道病原菌生長(zhǎng)及定殖，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，營養(yǎng)腸道黏膜，從而發(fā)揮顯著的益生效果[8-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，屬水平腸道菌群構(gòu)成差異分析提示乳桿菌屬豐度明顯下降，其合成乳酸和短鏈脂肪酸減少，從而抑制腸道上皮細(xì)胞再生，抗炎能力下降，加重肝臟損傷。提示在急性肝損傷治療中，通過微生態(tài)制劑的補(bǔ)充有助于改善腸道菌群構(gòu)成，減輕肝臟損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)在急性肝損傷中乳桿菌科豐度下降，故此，擬進(jìn)一步研究乳桿菌科在肝功能衰竭時(shí)對(duì)功能組學(xué)及代謝組學(xué)影響，深入探討臨床合理應(yīng)用益生菌的依據(jù)。