鱟血蛋白殼寡糖-透明質酸微球的制備及其活性分析

王耀祺，蔡鷹，康信煌，鄧春梅，吳育廉，張國光

（廣東海洋大學化學與環境學院，廣東 湛江 524088）

作為 “無脊椎動物獻血冠軍”的鱟，其血液中蘊含了許多珍貴的活性物質［1］。但是，其生物利用度較低，因此，本研究以殼寡糖、HA為原料，制備負載鱟血蛋白的微球，以提高其生物利用度。同時研究包載不同分子量鱟血蛋白的微球對α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶的抑制活性，為中國鱟藥用和保健價值的進一步開發利用提供更為豐富的實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

二級膜分離實驗機；核酸蛋白檢測儀；酶標分析儀；冷凍干燥機 （上海田楓實業有限公司）；紫外可見分光光度計；掃描電鏡；Zeta電位及粒度分析儀；低溫高速離心機

1.2 藥品與試劑

蛋白酶抑制劑Cocktail、胰蛋白酶、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、5，5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸、硫代乙酰膽堿、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、殼寡糖、透明質酸鈉

2 方法與結果

2.1 鱟血蛋白的提取

根據文獻［2-3］的方法，提取小于150、150～3000、大于3000的3段不同相對分子質量范圍的蛋白水解物A、B和C。本文以水解物C作為被包載物進行表征。

2.2 鱟血蛋白-COS-HA微球的制備

精密稱取5mg鱟血蛋白水解物，加入到含TPP的HA溶液中使其溶解。在攪拌條件下，將溶解好TPP、鱟血蛋白的HA溶液逐滴加入到殼寡糖水溶液中，攪拌30 min，即得鱟血蛋白-COS-HA微球混懸液，冷凍干燥后即得凍干粉。

2.3 正交實驗設計

以微球包封率為指標，通過探究殼寡糖濃度、pH值、HA和TPP的濃度優化最適條件。每個因素采用三個水平，按照L9（34）正交設計表進行試驗，因素表見表1，結果見表2。

表1 正交設計因素表

表2 正交設計結果分析表

由表2可知，微球制備的最佳條件為A1B2C2D2，即當殼寡糖質量濃度為2 mg／mL、HA質量濃度為0.1 mg／mL、TPP質量濃度為0.2 mg／mL及溶液pH為4.5時為最佳條件。

2.4 微球的表征

2.4.1 粒徑與表面形貌

取微球混懸液置于掃描電鏡中觀察表面形貌及測量尺寸，結果見圖1。

圖1 COS-HA微球的SEM圖

由圖1可知，鱟血蛋白-COS-HA微球呈球形或類球形，大小較均一，粒徑為 （3.11±0.42）μm。

2.4.2 Zeta電位的測定

取微球適量，用適量蒸餾水稀釋，置于Zeta電位及粒度分析儀中測定。結果，Zeta電位測定值為（-34.35±2.66）mV，體系穩定。

2.4.3 包封率和載藥量的測定

1）鱟血蛋白溶液標準曲線的制備。稱取鱟血蛋白5mg，添加PBS緩沖液配制成0.1mg／mL的標準蛋白液。取6只試管依次加入標準蛋白液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，再補充PBS溶液至1 mL，各加入5 mL考馬斯亮藍。混勻后，在室溫下靜置2 min，以1號管作空白對照，在波長595 nm處，測定吸光度，繪制標準曲線。標準曲線回歸方程為A＝6.615c+0.087，r＝0.9994。

2）包封率和載藥量的計算。在4℃條件下，將微球混懸液離心 （4000 r／min）20 min，分離上清液與沉淀。取上清液，于595 nm處測定鱟血蛋白的含量。沉淀用純化水洗滌，經冷凍干燥24 h后稱重即得載藥微球凍干粉。

計算公式：

包封率＝（W總-W游）／W總×100%；

載藥量＝（W總-W游）／微球質量×100%。

式中，W總為鱟血蛋白總藥量；W游為上清液中游離的鱟血蛋白藥量。

結果，包封率為 （60.57±0.52）%，載藥量為 （63.02±2.13）%。

2.4.4 體外釋放實驗

分別準確稱取一定量載藥微球、游離蛋白，混懸于3 mL pH6.8的磷酸鹽緩沖液介質中，使濃度達到3 mg／mL，置于透析袋內 （截留量70 kDa）懸浮于含有30 mL釋放介質的燒杯內，在37℃下恒溫振蕩 （100 r／min），分別在 1、2、3、5、7、9、12 h各準確取出1 mL釋放介質，并添加等量介質。取出的釋放介質于595 nm波長處測定吸光度。計算藥物的累積釋放率，并繪制體外釋放曲線。結果見圖2。

Q＝〔Cn×V0+（C1+C2+C3+……+Cn-1） ×V〕／m

圖2 鱟血蛋白原液與載藥微球的體外釋放曲線

由圖2可知，在第5h，鱟血蛋白原液累積釋放率達到91.01%，而載藥微球累積釋放率僅為43.21%，12 h后，鱟血蛋白原液基本釋放完全，而載藥微球僅釋放46.23%，說明具有緩釋效果。

2.5 微球對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

按照文獻方法［4］，取樣品混懸液加入酶液，37℃孵化10min，再加入底物，37℃反應30 min，測定A405，計算酶抑制活性，以阿卡波糖作為陽性對照，蒸餾水作為空白對照。

抑制率 ＝ 〔1-（As-Ac） ／Ab〕 ×100%

結果可知，水解物微球A和B對α-葡萄糖苷酶抑制能力都隨質量濃度增加而增長；當質量濃度達到0.2 mg／mL時，兩者最大抑制率分別達到（14.57±0.50）%和（14.21±0.60）%，水解物C微球則對α-葡萄糖苷酶基本沒有抑制活性，但都少于阿卡波糖的最大抑制率（28.42±0.20）%。

2.6 微球對乙酰膽堿酯酶的抑制活性

參照Ellman＇s比色法，取樣品溶液加入乙酰膽堿酯酶液、5，5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸溶液和PBS溶液，于37℃孵化2 min，然后加入硫代乙酰膽堿溶液，37℃孵化30 min，測定A410，以石杉堿甲作為陽性對照，蒸餾水作為空白對照。按上式計算酶抑制活性。

結果可知，在0～0.04 mg／mL范圍內，微球和石杉堿甲抑制乙酰膽堿酯酶的能力均隨濃度的增加而增加；達到0.04 mg／mL后，酶抑制能力不再顯著增長。與石杉堿甲最高抑制率（99.22±0.60）%相比，微球水解物A和B的最高抑制率分別為（43.92±0.40）%和（30.58±0.50）%，微球水解物C的酶抑制活性最好為（67.45±0.20）%。

3 討論

本研究從鱟血中成功提取并水解分離得到三種不同分子量的鱟血蛋白水解物并將其制備成鱟血蛋白殼寡糖-透明質酸微球，其生物相容性高，藥物釋放具有明顯的緩釋效果，三種蛋白水解物微球對α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶具有一定抑制作用。