苦蕎黃酮的提取工藝及測定方法研究進展*

蘇學軍，梅 穎，趙 靜

（泰州職業技術學院，江蘇 泰州 225300）

苦蕎又名韃靼蕎麥，是一種對惡劣生存環境具有較強適應能力的藥食同源作物[1]，在我國西南、華北地區廣為栽培與種植，具有卓越的營養及保健功效?？嗍w蛋白生物價高、人體必需氨基酸種類齊全，其膳食纖維含量豐富，所含脂肪酸主要為不飽和的油酸和亞油酸，并含多種維生素和礦物元素[2,3]，更為重要的是苦蕎中含有與人體健康緊密相連的多酚、多糖、活性肽等多種生物活性成分。其中，多酚中的黃酮類化合物是苦蕎中含量最多、也是最重要的活性成分，它包括蘆丁、槲皮素、山奈酚和花青素等[1]，遍布于苦蕎的花、莖、葉、籽粒等器官中?？嗍w黃酮能夠降血糖、降血脂、抗缺血、清除體內自由基、抑制癌細胞增殖、改善記憶力，藥用功效顯著[4]。本文綜述了苦蕎黃酮的提取工藝及含量測定方法，以期為進一步推動苦蕎資源的綜合利用，提供科學依據。

1 提取方法

1.1 溶劑浸提法

黃酮類化合物因結構和存在狀態不同，其溶解度也存在較大差異。水、甲醇、乙醇是傳統的黃酮提取溶劑，提取時一般根據目標物的極性大小，常選擇一定濃度的醇-水溶液浸提。按操作方式可分為熱回流提取、索氏抽提、熱水浸提等。米智等[5]以濃度為80%的乙醇溶液為提取劑，采用索氏抽提法提取苦蕎黃酮，經正交實驗優化后，發現在最佳工藝條件下需提取3 次，回流1.5h，黃酮才有較高得率。扶慶權[6]的研究表明，加熱回流條件下，苦蕎黃酮最優提取工藝條件為：使用體積分數為70%的乙醇溶液，在80℃下連續回流1h，此時苦蕎總黃酮提取率可達7.85%。這些研究表明，采用溶劑浸提法提取，設備簡單，操作成本低，但存在操作費時，能耗高，溶劑用量大且回收難等缺點。

1.2 超聲波輔助提取法

苦蕎黃酮的提取過程是一個相際間的傳質過程，即黃酮在濃度差的作用下由苦蕎組織內部向提取劑進行滲透擴散。超聲波產生的強烈的空化效應、機械效應與活化效應[7]，極易破壞植物的細胞壁，加速細胞內黃酮的釋放。同時，超聲場引起的攪拌、擾動、湍動和旋渦運動，使傳質阻力減少，提取劑的穿透力增強，這有助于苦蕎黃酮的高效率提取。王斯慧等[8]采用超聲波輔助乙醇提取苦蕎麩皮中的總黃酮，研究表明，與傳統有機溶劑提取工藝相比，超聲波提取可降低提取溫度，縮短提取時間，且得到的黃酮化合物的純度及二次提取率均較高。王麗娟等[9]在提取黑苦蕎中黃酮類化合物時，利用單因素及正交實驗優化了超聲提取工藝，得優選后的工藝條件為：在超聲功率400W 條件下，體積濃度為80%的乙醇按料液比1∶15（g∶mL）在60 ℃下浸泡提取，黃酮提取率為4.58%。上述試驗表明，超聲波輔助提取具有操作易、效率高、產物品質高、提取成本低、生產周期短等優點，但在超聲場下進行規模提取尚有困難。

1.3 微波輔助提取法

微波的輔助作用可歸因于其穿透溶劑后能直接深入細胞內部，產生的微波能可為細胞吸收并快速轉換為熱能，使細胞內部溫度瞬間升高，致壓力激增，當細胞壁無法承受高壓時便發生破裂，細胞內部目標組分得以釋放，并迅速傳遞至周圍溶劑而溶解。微波產生的熱效應，可提高擴散系數，并使固液界面間的有效層流膜層變薄，增強了傳質的推動力，提高了黃酮的得率。李富蘭等[10]以提取率為目標，研究了苦蕎茶中黃酮的提取工藝，得出苦蕎茶粉末按1∶20（g∶mL）料液比加入濃度為70%的乙醇溶液，微波功率300W，提取時間3.0min，該最佳組合條件下黃酮的提取率可達4.13%。梁虓等[11]將微波提取技術與傳統回流提取法相結合，對苦蕎籽樣品先進行微波預處理，然后于80℃下水浴回流提取，響應曲面法優化出最佳提取工藝條件，經驗證試驗表明，黃酮得率為5.02%，與預測模型符合度較好。相比于其他提取方法，微波法具有選擇性高，可節省溶劑，提取時間短，安全環保等優點；不足之處是提取過程溫控不易操作，會產生局部過熱現象，部分黃酮可能會分解失活，影響了產品品質及最終得率。

1.4 超臨界萃取法

超臨界萃取法是利用某些萃取劑在超臨界區所表現出的特殊的溶解性能來實現對目標物的萃取，并通過改變溫度和壓力讓萃取劑和目標物分離的一種現代萃取技術。郭月英[12]以蕎麥殼為原料，研究了超臨界CO2萃取苦蕎黃酮工藝，得出最優工藝條件為：選擇乙醇為夾帶劑，控制萃取壓力25MPa，固液比為1∶10，35℃下萃取4h。譚光迅[13]的研究表明，壓力和溫度是影響超臨界萃取的主要因素，萃取前若能將萃取釜保壓一段時間，可以使苦蕎黃酮的提取率提高近33.33%。超臨界萃取可在常溫下操作，操作條件易控，無有機溶劑殘留，特別適合于非極性化合物的提取，但該法存在設備投資費用較高，日常維護繁瑣等缺陷。

1.5 超高壓提取法

超高壓提取技術是指在超高壓釜內加壓，使密閉體系壓力升至100～1000MPa 處理植物原料，使細胞組織結構發生破壞，目標組分得以更多更快地轉移到提取溶劑，進而獲得高提取效率的一種新興提取技術[14]。王居偉等[15]研究了超高壓法提取苦蕎黃酮工藝，采用Box-Behnken 試驗設計優化確定最優工藝條件為：壓力388.1MPa，保壓時間8.09min，乙醇體積分數為95.31%，液料比為19.82（mL∶g），在此條件下提取的苦蕎黃酮得率為2.185%，而傳統回流提取法只有1.982%。該法提取耗時短，可在常溫下操作，能很好地保留黃酮的生物活性。

1.6 酶輔助提取法

因目標化合物主要存在于植物的細胞壁內，而細胞壁的致密結構使活性組分難以擴散到提取溶劑中，若經恰當的纖維素酶、果膠酶處理，則可提高細胞壁的通透性，增加溶劑的可及性，降低溶出阻力，還能在一定程度上提升產品的品質。李會瑞等[16]研究了纖維素酶提取苦蕎茶中總黃酮工藝，在醇提條件不變的情況下，考察了酶解pH 值、酶用量、酶作用時間等因素對提取率的影響，經響應面分析優化確定：酶用量0.6%，在pH 值為5.0、40℃條件下，酶解90min，苦蕎茶中總黃酮提取率為1.497%。與乙醇浸提法相比，酶解法使總黃酮的提取率增加了34%。

1.7 減壓內部沸騰法

減壓內部沸騰法是目前應用于植物活性組分提取的一種較為高效實用的提取技術。該法是讓低沸點的有機溶劑充分滲入植物組織內部，然后加入沸點較高的熱溶劑，在一定的真空度下使內部有機溶劑迅速發生沸騰而汽化，進而加快被提組分解吸的一種提取方法。王九峰等[17]的研究表明，采用減壓內部沸騰法提取苦蕎籽粒中的總黃酮時，通過Plackett-Burman 實驗篩選出對總黃酮得率有顯著影響的實驗因子為真空度、乙醇濃度、提取時間和提取溫度，而溶劑用量不是顯著因子。再以響應面法優化出最佳工藝參數，發現黃酮得率最高時提取溫度較低，為52℃，提取時間僅需5min。由此可見，內部沸騰法在天然活性成分提取方面有著獨特的優勢，可以減少高溫對活性組分的破壞，縮短提取時間、降低溶劑的使用量，且在一定程度上提高了提取效率。

2 測定方法

2.1 光譜法

光譜法是測定苦蕎中黃酮類化合物應用廣泛且重要的分析方法，主要有紫外可見分光光度法、熒光光度法、流動注射分光光度法等[18]。其中，分光光度法因操作簡單、設備及檢測投資少、準確度高、重現性好而成為目前苦蕎中總黃酮測定最常用的檢測方法。該法是利用黃酮類化合物能與一些金屬離子發生絡合作用，生成穩定的有色絡合物，然后在特定波長下測出吸光度，來實現定量分析，常使用的絡合劑為Al（NO3）3和AlCl3。

王銳等[19]采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 比色法，對云南昭通大山包的系列苦蕎產品中的總黃酮含量進行測定。經方法學考察，該法簡便快捷，結果可靠，研究發現黃苦蕎仁中總黃酮含量較黑苦蕎仁中要高，苦蕎仁經炒制加工后黃酮含量會增高。韓旭等[20]系統比較了Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 和AlCl3-NaAc 兩種方法在對苦蕎酒中的總黃酮進行分析測定時的差異，結果表明，Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 法測定的結果偏高，分析可能是苦蕎中的一些多酚類物質，如肉桂酸類、原花色素等物質在510nm 處參與了顯色。因此，AlCl3-NaAc 法測定苦蕎黃酮的專屬性高，結果更為可靠，需要注意是使用AlCl3-NaAc 法應在顯色反應發生后30min 內進行測定，否則結果會發生偏差。

由于黃酮能與鋁離子在一定條件下形成穩定的強熒光絡合物，近年來，熒光分光光度法測定苦蕎中黃酮已引起學者們的關注。李小梅等[21]建立了一種流動注射液滴熒光增敏法測定苦蕎中的蘆丁含量測定方法。樣品經超聲振蕩萃取后，含蘆丁的上清液中加入適量0.1mol·L-1的Al3+，生成了Al3+-蘆丁絡合物，再選擇激發波長239nm、發射波長507nm 測定熒光強度，該法的檢出限較低，為0.02mg·L-1，回收率為86.0%～104%，RSD 為3.1%～6.1%。實際檢測時要注意絡合物的熒光強度會受共存的金屬離子Cr3+、Hg2+、Fe3+的干擾。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）分析黃酮類化合物具有靈敏度高、進樣量少、可批量測定等優點，能滿足苦蕎中多種黃酮類組分的同時測定。對苦蕎黃酮進行定性定量分析時，常與紫外、熒光、二極管陣列檢測系統相結合，可以快速、準確實現對目標組分的檢測，適用范圍較廣。

張繼斌等[22]采用HPLC 法測定四川、云南、貴州、陜西不同產地的苦蕎麥中黃酮類成分，先以熱水浴回流提取樣品中活性組分，再以乙腈-0.1% H3PO4溶液為流動相，經Sepex C18色譜柱分離，紫外檢測器在360nm 處測定4 種黃酮類成分的含量。結果表明，不同產地的黃酮類成分含量存在一定的差異，云南產的苦蕎麥中槲皮素、山奈酚的含量明顯要高于其他地區，而不同地區樣品中的蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷的含量相差不明顯。張莉等[23]選用Wondasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為甲醇-0.4% H3PO4溶液（60∶40）；測定波長為370nm，HPLC 法測定了苦蕎麥不同部位槲皮素的含量，得出同一品種苦蕎不同植株部位的槲皮素含量為葉>莖>根。鄭瑾等[24]在研究酸水解工藝條件對苦蕎提取物中槲皮素含量影響時，采用HPLC 法測定提取物中蘆丁和槲皮素的含量。測定方法學考察表明，蘆丁和槲皮素的線性范圍分別為0.093～291.2μg·mL-1、0.167～259μg·mL-1，精密度和重復性的RSD 均小于1.24%，方法的穩定性較好，并得出在最佳水解工藝條件下，苦蕎醇提物中有64.11%的蘆丁可轉化為槲皮素，藥代動力學表明，水解后的苷元槲皮素更易被腸道吸收。

對于含量較低的黃酮類化合物，僅用高效液相色譜法分析往往難以獲得有效分離和準確定量，將色譜技術與質譜技術聯用，可對目標組分進行有效識別，并可對物質結構進行解析。薛長暉[25]采用HPLC-UV/ESI-MS 技術對來自山西靈丘的苦蕎粉中的黃酮類化合物進行了分離識別，共分離出5 種黃酮類化合物，并首次發現六取代黃酮和槲皮素-3-雙鼠李糖苷是苦蕎粉的重要組成。李欣等[26]建立了一種超高液相色譜-串聯四極桿質譜法（UPLCMS-MS）對苦蕎麥中蘆丁、槲皮素和山奈酚含量進行測定的方法。結果表明，3 種黃酮組分的線性范圍為0.1～100μg·mL-1，相關系數r2大于0.99，高、中、低三水平加標回收率均在94%以上，蘆丁的最低檢測水平為0.01ng·mL-1，其余兩種物質為0.1ng·mL-1。此法具有預處理簡單，分析耗時少，靈敏度高，選擇性強等特點。

2.3 毛細管電泳法

毛細管電泳法是一種發展較為迅速的液相分離技術，具有試劑及進樣量少，分離分析時間短，分辨率高，樣品預處理方便，能滿足目標化合物的快速微量分析要求。目前，報道的方法中，對苦蕎中黃酮類化合物分離是通過選擇合適的緩沖溶液和添加劑，讓黃酮組分帶電，在電場中實現高效分離。侯建霞等[27]建立了一種毛細管電泳結合電化學檢測方法，可對苦蕎麥芽中的表兒茶素、蘆丁、槲皮素3 種黃酮類物質實現分離檢測。在以50mmol·L-1的硼砂-硼酸緩沖液為運行液，pH 值為8.5，分離電壓為20kV的條件下，3 種組分能在12min 內實現完全分離，加標回收率分別為100.6%、99.1%、101.1%。此法檢出限較低，重現性好，有望應用于苦蕎芽菜及苦蕎產品中黃酮物質的快速分離檢測。郭芳芳等[28]采用高效毛細管電泳法對5 個不同產地的苦蕎中的黃酮組分進行測定，樣品經超聲波輔助醇提法提取后，離心分離，取上清液過濾分析，在最佳檢測條件下，苦蕎醇提液中4 種黃酮類化合物可在7min 內得到分離，方法的檢出限較低，平均回收率為95.5%～104.7%，RSD 小于3.66%。毛細管電泳法目前應用于苦蕎中黃酮物質的分析目前報道較少，未來有很大的發展空間。

3 結語

苦蕎是提取天然活性成分黃酮類化合物的優質植物資源，近年來不斷有新的提取方法被開發應用于苦蕎中黃酮的提取，但這些方法得到的工藝參數目前尚限于小試規模，今后應加大工業化提取工藝參數的研究，規?；奶崛≡O備也需同步研發。由于紫外分光光度法測定的是苦蕎中的總黃酮的含量，隨著苦蕎中黃酮新類型的不斷發現，對不同黃酮成分實行定性定量檢測，就需進一步加強高效液相色譜法、毛細管電泳法、色譜-質譜檢測法及聯用檢測技術的開發與應用。隨著提取技術和檢測技術的發展，苦蕎黃酮在新的食品添加劑、保健品及藥品中應用將更為廣泛。