新型冠狀病毒病原學特征與致病機制研究進展

高光俊，穆廷杰，馬娟娟，徐興然，徐杰

1 甘肅省臨夏州人民醫院，甘肅臨夏731100；2 西南大學藥學院；3 蘇州大學第一附屬醫院

自2019年12月底以來，從中國武漢等地區發現了多例“不明原因的病毒性肺炎”病例，此后包括中國在內的多個國家出現并呈現出全球爆發流行的態勢，為一種先前尚未發現的冠狀病毒株系所致的急性呼吸道傳染病［1-2］。此后，世界衛生組織（WHO）將其命名為2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV），由此感染的肺炎命名為“COVID-19”，國際病毒分類委員會將該病毒命名為“SARS-CoV-2”。由于這種新型冠狀病毒高致病能力和傳染特性，我們國家迅速將其納入法定傳染病乙類，采取甲類傳染病進行防控管理。2019-nCoV 所致的突發疫情給全球公共衛生安全帶來了嚴重的挑戰和威脅，引發了全球的高度關注。目前尚沒有特效治療藥物與安全有效性疫苗。系統深入了解2019-nCoV 新型冠狀病毒的相關病原學特征與致病機制對于COVID-19 防治具有重要意義，近期有關此方面的研究取得了不少成果，現將2019-nCoV 的病原學特征及致病機理等研究進展作一綜述。

1 2019-nCoV起源與生物進化

早期武漢地區感染患者病毒基因組學研究發現，2019-nCoV 與β 冠狀病毒相匹配，與MERS-CoV和SARS-CoV 的同源性僅為50%和79%，而與蝙蝠分 離 的SARS 樣 冠 狀 病 毒（bat-SL-CoVZC45，MG772933.1）同源性超過85%，進化關系上2019-nCoV 更接近于蝙蝠來源的兩種SARS 樣冠狀病毒，其親緣關系最為密切，提示蝙蝠可能是2019-nCoV宿主［3-4］。同源建模顯示，2019-nCoV與SARS-CoV具有相似受體結合域，盡管存在部分殘基的變異，但是其感染機制可能與SARS-CoV 存在相似的發病機制［4］。基于高通量的NGS 研究發現，2019-nCoV 為SARS 樣冠狀病毒（>87.1%），與SARS 高度同源（同源性79.5%），具有SARS 同源的ORF1ab 位點（同源性94.6%）和非結構性蛋白，與SARS 屬同種，這也是命名為SARS-CoV-2的緣由［5］。2019-nCoV 不同于其他β 冠狀病毒的是具有可供Furin 蛋白酶切的位點和插入“CGGCGG”序列，提示此突變可能和侵染細胞效率增強有關，進而使其傳播力顯著高于SARS［6］。作為RNA 病毒的2019-nCoV 由于其復制酶缺少校正功能，在自然界與動物體內復制過程中發生重組和變異的概率高，容易引起生物學結構和特性的變異，甚至誘發突變株或新毒株的出現，提示要高度重視病毒的變異和進化趨勢。基于基因組數據闡述病毒在人群傳播中的演化發現，2019-nCoV存在149 個突變位點，且多為近期發生。依據第8782位和28144位兩個高度連鎖突變位點將病毒分為L 型和S 型，S 型與蝙蝠冠狀病毒更接近，進化上也更為原始，L型（毒力傳播能力強）則可能由S型演化而來。有72 株（約70%）為“L”型，29 株（約28%）為“S”型。在時空分布上，武漢患者L 型占96.3%，武漢外患者L 型占61.6%，表明病毒爆發早期以L型為主導，武漢主要感染類型為L型，隨著病毒的持續傳播，S 型逐漸上升至38%。表明人為干預如醫療和隔離措施加強后，選擇壓力的變化使病毒從L型為主導變為S 型主導，L 型負選擇壓力更大，感染變少；而毒性更低的S型傳播范圍則更廣［7-8］。

2 2019-nCoV的病原學特征

冠狀病毒是一類屬于網巢病毒目、冠狀病毒科的一類具有囊膜、基因組為線性單股正鏈RNA 的病毒，是自然界廣泛存在的一類病毒?；诜N系發生和基因組學可將冠狀病毒分為α-冠狀病毒（α-CoV）、β-冠狀病毒（β-CoV）、γ-冠狀病毒（γ-CoV）和δ-冠狀病毒（δ-CoV）等四個類型。其中，δ-CoV 和γ-CoV 包括IBV、HKU11 能夠感染禽類，部分種類也能感染哺乳類動物［9］。α-CoV 和β-CoV 僅感染哺乳類動物可引起人類嚴重呼吸道疾病和動物胃腸道疾病，主 要 包 括HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoVOC43、HKU1 和SARS-CoV、MERS-CoV 等病毒。前4種通常會導致免疫正常個體普通感冒癥狀，而SARS-CoV、MERS-CoV 能引起人類嚴重呼吸道疾病綜合征?；诜肿舆z傳學證實，SARS-CoV、MERSCoV、HCoV-NL63、HCoV-229E 為蝙蝠來源病毒，HCoV-OC43和HKU1來源于嚙齒類。而某些馴養動物作為中間宿主在病毒從天然宿主轉移至人類過程中具有十分重要的作用［10］。

2.1 2019-nCoV 生物學特性 2019-nCoV 屬于β 冠狀病毒屬，為第7 種被鑒定出的可引起人類感染的新型冠狀病毒，是引發全球多地感染性肺炎暴發流行的病原，為第7 種被鑒定的可引起人類感染的新型冠狀病毒。通過負染電鏡對病毒顆粒進行觀察，發現2019-nCoV呈球形，表現為多形性，直徑在60～140 nm。病毒顆粒呈現了日冕狀，具有包膜和明顯蛋白刺突結構（9～12 nm）。體外培養發現，在感染人呼吸道上皮細胞96 h 后可出現細胞病變（CPE），并能夠在電鏡下觀察到病毒顆粒表面的纖毛結構，而感染Huh-7和Vero-E6細胞后需常規培養6 d后才出現細胞病變現象［3］。

2.2 2019-nCoV 基因組學與毒力因子 冠狀病毒為RNA 病毒，具備典型5’端甲基化“帽”，3’端PolyA“尾”結構，能夠編碼結構蛋白與輔助蛋白。其中，刺突蛋白（S 蛋白）、膜蛋白（M 蛋白）、包膜蛋白（E 蛋白）、核衣殼蛋白（N 蛋白）是冠狀病毒最為重要的4 種結構蛋白［11］。2019-nCoV 屬β 冠狀病毒屬，具有冠狀病毒典型基因組結構，包括6 個主要ORF 和其他結構基因。主要包含有5′非翻譯區（UTR）、復制酶復合物（orf1ab）、S 基因、E 基因、M 基因、N基因、3′UTR和幾個未識別的非結構ORF等基因 結 構［3］。 2019-nCoV 基 因 組（GenBank：MN975262）亦具有典型的冠狀病毒結構，含29 891個核苷酸，G+C 占比約38%，編碼9 860 個氨基酸，UTR 和編碼整段多聚蛋白的開放閱讀框（ORF），其結構順序依次為5′復制酶（orf1/ab）—結構蛋白［Spike（S）-Envelope（E）-Membrane（M）-Nucleocap?sid（N）］-3′，但缺乏β 類冠狀病毒所具有的血凝素酯酶基因結構；占基因組全長1/3 的ORF 含有一個保守的小向導RNA（sgRNA），9 個轉錄調控序列（TRS）（ACGAAC或CUAAC形式）和2個末端非翻譯區（UTR），約占基因組全長2/3 的orf1a/b 編碼多聚蛋白酶（pp1a/pp1ab），由16 個非結構蛋白（NSP）組成。

S蛋白由兩個亞基S1與S2組成。S1亞基包含1個信號肽、N 端結構域（NTD）和受體結合域（RBD），而S2 亞基包含融合肽（FP）、七肽重復序列1 和2、跨膜結構域和胞內結構域，表明S 蛋白RBD 區域與人體血管緊張素轉化酶2（ACE2）的作用在病毒結合、吸附中具有十分重要的作用，可作為藥物和疫苗研發的重要作用靶點。E 蛋白包含疏水結構域和跨膜α 螺旋結構域，是病毒包膜組成部分，并參與病毒顆粒組裝和釋放。M 蛋白含有3 個跨膜結構域和1 個保守結構域，是病毒包膜的組成部分，參與病毒顆粒的組裝和釋放［12-14］。N蛋白序列保守程度高，在病毒復制過程中發揮重要作用。N 蛋白與病毒RNA 結合形成復合體，隨后在M 蛋白和E 蛋白的共同作用下，包裹后進入病毒衣殼中［15-16］。

熊子軍等對2019-nCoV 與SARS 基因組數據全基因組序列信息對2019-nCoV 基因組結構、功能與致病亞型進行相關的分析發現，SARS-CoV-2 有11個功能基因，其中3個同源于SARS，7個同源于蝙蝠冠狀病毒，1個功能未知。2019-nCoV 基因組存在毒株差異，表現為蛋白編碼基因區域含17 個SNPS，可能引起致病基因變異。非蛋白編碼區域含5 個SNP。ORF3a 和ORF8 基因的蛋白序列存在變異。通過對全基因組序列比對發現2 個毒株的2 個序列存在缺失，即起始端的15 個堿基和序列末端的11個堿基缺失［17］。

3 2019-nCoV的致病機制

2019-nCoV 主要侵犯肺泡上皮細胞，潛伏期為1～14 d，最長達24 d，2019-nCoV 感染患者的臨床癥狀與SARS-CoV 和MERS-CoV 感染相似，以發熱、干咳為主。多數呈輕癥狀態，表現為低熱、輕微乏力，但無肺炎癥狀。重癥多集中在老年或有嚴重基礎疾病患者，多在感染后1周出現呼吸困難，然后發展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒血癥等。 影像學CT 顯示肺部呈多發性磨玻璃影和浸潤影，甚至肺實變［1］。

3.1 2019-nCoV S 蛋白與ACE2 蛋白結合 S 蛋白與ACE2 蛋白的結合是2019-nCoV 感染人體細胞的關鍵。2019-nCoV S 蛋白受體結合域與SARS-CoVs（73.8%～74.9%）、bat-CoV（75.9%～76.9%）氨基酸序列和蛋白結構序列上存在高度同源性、關鍵氨基酸高度保守性及被感染細胞類型的一致性，表明2019-nCoV 存在著相似的結合受體和入侵過程［4，18］。研究證實，ACE2 受體是2019-nCoV 進入細胞的入口，蛋白酶處理可以增強病毒的侵染水平［19］。細胞絲氨酸蛋白酶TMPRSS2 和組織蛋白酶CatB/L 能夠協同激活SARS-2-S 入侵細胞，而蛋白酶TMPRSS2的作用更為關鍵，同時發現絲氨酸蛋白酶抑制劑卡莫 司 他（Camostat）能 夠 阻 斷2019-nCoV 感 染［18］。2019-nCoV S 蛋白以三聚體形態存在，S1 亞基受體結合域（RBD）（21 kD）則以鉸鏈式構象變化來隱藏或暴露受體結合的關鍵位點。結構生物學證據顯示，2019-nCoV S 蛋白結合ACE2 的親和力要遠高于SARS-CoV（>10～20 倍），這可能是其高傳染性的原因。2019-nCoV 與蝙蝠冠狀病毒RaTG13 S 蛋白序列同源性高達96%，但最顯著變化是具有S1/S2蛋白酶切割位點“RRAR”氨基酸序列，此現象常見于流感病毒血凝素的變異［20］。2019-nCoV 與SARS 高度同源且具有相似入侵機制，提示樹突狀細胞（DCSIGN 等）和肝竇、淋巴結內皮細胞（L-SIGN）等SARS受體也可能與2019-nCoV 的感染相關［21］。ACE2 是SARS-CoV 表面受體，可直接作用于SARS-CoV 表面S 蛋白。ACE2 結構學研究發現，ACE2 由于肽酶結構域的轉移而具有開放和關閉兩種構象變化，但兩種構象均存在于冠狀病毒相互識別界面，2019-nCoV 的RBD 會被ACE2 的胞外肽酶結構域（PD）通過極性殘基所識別，三聚體S蛋白與二聚體ACE2相容性結合就表明兩者間可能存在聚類作用或以胞膜內陷的內吞機制，為SARS-CoV-2感染機制和治療提供新線索和思路［22-24］。與SARS-CoV 相似的是ACE2也是SARS-CoV-2 RBD 的結合受體，RBD 序列和結構的高度保守特性是結合ACE2 的關鍵［25］。2019-nCoV 均能進入表達ACE2 的多種細胞，但無法有效進入ACE2 缺失的細胞或其他受體的細胞，表明ACE2 可能是2019-nCoV 的潛在受體，且2019-nCoV并不能利用N-氨基肽酶、丙氨酸肽酶等其他冠狀病毒的病毒受體［2］。肺部Ⅱ型肺泡上皮細胞（AT2）除表達大量ACE2 受體外，還參與大量與病毒復制相關的其他基因，促進病毒的感染，提示基于ACE 受體或相關基因的干預策略可能是阻斷病毒感染、進行藥物開發和治療的有效途徑［25］。

3.2 2019-nCoV 感染引發的炎癥因子風暴 近期有文獻報道2019-nCoV 感染患者前期病癥較輕，但后期又突然加重，甚至出現死亡，疾病的突發轉變與炎癥風暴相關［1］?！把装Y風暴”即“炎癥因子風暴”，指患者體內各類細胞因子如INF、IL、CK、CSF、TNF 等炎癥因子不受調控的過度釋放，從而導致機體嚴重的細胞因子風暴和細胞因子釋放綜合征（CRS）。目前，炎癥風暴產生的成因還不明確，一般認為是免疫系統對新的、高致病的病原體產生的過激反應，即免疫調控網絡失衡、負反饋的缺失和正反饋的不斷自我放大，使得多種細胞因子異常升高，最終導致炎癥因子風暴。研究發現，2019-nCoV 感染致重癥肺炎炎癥風暴及引起的免疫損傷在COVID-19 的發生和發展中發揮了作用，組織病理學以滲出、出血、炎癥細胞浸潤、肺泡上皮細胞損傷及纖維化為主要特征，大量免疫細胞和組織液聚集在肺部，會阻塞肺泡與毛細血管間的氣體交換，大量滲出液聚集使氣道阻塞，導致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。既往研究發現，大量細胞因子的快速產生能夠誘發免疫病理損傷，是引起ARDS和多器官衰竭的重要原因。AR?DS 的發病原因是由于細胞因子風暴造成的肺毛細血管內皮細胞以及肺泡上皮細胞的彌漫性損傷。

綜上所述，2019-nCoV 為SARS 樣冠狀病毒，具有可供Furin 蛋白酶切的位點和插入“CGGCGG”序列。2019-nCoV 特有的生物學特性、基因變異性、毒力因子等可能是導致其在傳染性、變異性和適應性方面更強的主要原因。S 蛋白與ACE2 蛋白的結合侵犯肺泡上皮細胞是入侵的主要機制，加之炎癥因子風暴加劇了疾病的進展。當前2019-nCoV 引發的肺炎疫情仍在全球肆虐，已有部分疫苗開始對人群接種，這對保護易感人群至關重要。而病毒溯源、病毒傳播、基因變異、宿主免疫等有待進一步揭示，對SARS-CoV-2 病原學及其致病機理的深層次的研究是揭示疾病發生、傳播、流行的重要途徑，是更加有效地進行針對性防治的基礎。