Nrf2及其信號(hào)通路在肝缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展

李日，付冉，余偉明，溫軍業(yè)，趙世叢，李越昌，張萬(wàn)星

1 華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，河北唐山063000；2 河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；3 河北省人民醫(yī)院；4 河北北方學(xué)院研究生學(xué)院

肝缺血再灌注損傷（IRI）是肝移植、肝切除、低血容量性休克和創(chuàng)傷過(guò)程中最常見(jiàn)的組織損傷類型，它的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜、多因素的過(guò)程，涉及了多種細(xì)胞損傷機(jī)制。其中，缺血期出現(xiàn)的組織缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、代謝反應(yīng)中斷等因素可損害線粒體活性，而線粒體功能障礙可誘導(dǎo)活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷［1］，再灌注期則可使得炎癥介質(zhì)、凋亡介質(zhì)以及ROS 等介質(zhì)被激活，造成組織功能的惡化［2］。肝IRI 的防治策略主要包括缺血預(yù)處理、藥物預(yù)處理及缺血后處理等，但其效果并不突出。在參與減輕肝臟IRI 的轉(zhuǎn)錄因子中，核因子紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（Nrf2）是細(xì)胞內(nèi)抗氧化過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子［3］，Nrf2 的激活可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列活性酶，使其具有明顯的抗炎、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激等細(xì)胞保護(hù)作用。近年，越來(lái)越多的研究證實(shí)Nrf2 對(duì)肝臟IRI 有保護(hù)作用［4］，且有關(guān)其對(duì)肝臟IRI 的作用及機(jī)制方面的研究也取得了一些成績(jī)。現(xiàn)就肝IRI 中Nrf2相關(guān)的信號(hào)通路及其作用的研究進(jìn)展作以下綜述，以期為肝IRI的治療提供新的治療靶點(diǎn)及策略。

1 Nrf2的結(jié)構(gòu)

Nrf2 起初克隆自人類白血病細(xì)胞株，并被鑒定為Cap-n-collar 堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，是具有神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其含有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）結(jié)構(gòu)，除此之外，Nrf2 還有6 個(gè)高度保守的環(huán)氧丙氯相關(guān)蛋白同源結(jié)構(gòu)域（Neh），包括Neh1～Neh6。其中，Neh1 區(qū)的C端bZIP 結(jié)構(gòu)在Nrf2 與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的識(shí)別與結(jié)合中發(fā)揮著重要作用，并可啟動(dòng)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄；Neh2 區(qū)位于結(jié)構(gòu)的氨基端，其包含的DLG 和ETGE 兩個(gè)基元可作為Nrf2 與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（KEAP1）的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)Nrf2 的活性起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，與KEAP1 的結(jié)合使得Nrf2 被錨定于胞質(zhì)中而處于失活狀態(tài)；Neh3 區(qū)位于結(jié)構(gòu)的羧基端，可與輔助因子結(jié)合活化轉(zhuǎn)錄，Neh4 和Neh5 同樣可對(duì)Nrf2 的轉(zhuǎn)錄起到活化作用，當(dāng)Nrf2 轉(zhuǎn)移入核后可以Nrf2-Maf 二聚體的形式與ARE 結(jié)合，在共激活因子cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的共同作用下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，Neh6 區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)錄起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，主要負(fù)責(zé)Nrf2的降解［5-6］。

2 Nrf2在肝IRI中的作用

2.1 抑制氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激時(shí)，由于機(jī)體受外界刺激，體內(nèi)ROS 大量產(chǎn)生，ROS 則可誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、蛋白質(zhì)氧化、線粒體功能障礙和DNA 損傷，在缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷中起關(guān)鍵作用［2］。Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核后可與ARE 結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)II相代謝酶和抗氧化酶基因表達(dá)，如血紅素氧合酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）、醌氧化還原酶-1（NQO1）及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）等來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激。此外，肝細(xì)胞激活Nrf2 可導(dǎo)致NADPH 升高，從而防止肝臟氧化損傷。有研究表明，Nrf2通路激活劑（dh404）預(yù)處理可顯著增加谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）和谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基（GCLM）的表達(dá)，并可適度減少肝細(xì)胞損傷［7］。15-脫氧-Δ12，14-前列腺素J2（15d-PGJ2）是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 的天然配體之一，15d-PGJ2 對(duì)肝IRI 小鼠的預(yù)處理可誘導(dǎo)Nrf2 的核易位并激活Nrf2，誘導(dǎo)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1、NQO1 和GCLC 的表達(dá)，以Nrf2 依賴的方式保護(hù)肝臟免受IRI 損傷［7］。除此之外，CHEN 等［8］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)富馬酸和姜黃素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可顯著誘導(dǎo)Nrf2 的表達(dá)，提高肝臟三羧酸循環(huán)水平，有效介導(dǎo)HO-1 等抗氧化酶的表達(dá)，從而抑制肝IRI模型的氧化應(yīng)激水平。

2.2 抑制炎癥 炎癥反應(yīng)在肝臟IRI 的發(fā)生中起著重要作用，中性粒細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的聚集和活化可導(dǎo)致肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；腫瘤壞死因子α（TNF-α）等體液因子則可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的聚集和活化，造成肝細(xì)胞損傷［9］。近年越來(lái)越多的證據(jù)表明，Nrf2 可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而減 輕 肝 臟IRI。MASUDA 等［7］選 用Nrf2 激 動(dòng) 劑（dh404）對(duì)肝IRI 大鼠進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)激動(dòng)劑處理組大鼠的肝臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及髓過(guò)氧化物酶活性均顯著低于對(duì)照模型組，且肝臟的病理學(xué)損傷有明顯的改善，提示Nrf2 的激活可抑制肝IRI 中的炎癥反應(yīng)進(jìn)而減輕肝臟損傷。TAO 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，薔薇果總黃酮可改善肝臟IRI，其可通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路而抑制炎癥因子白介素-1β、白介素-6和TNF-α的表達(dá)，提示Nrf2 可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而減輕肝臟IRI。

2.3 抑制細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的不可逆喪失，隨著對(duì)細(xì)胞凋亡研究的進(jìn)一步深入，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在肝IRI 進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。輔酶Q10 是一種強(qiáng)抗氧化劑，當(dāng)輔酶Q10 作用于肝IRI 模型大鼠時(shí)，不僅可通過(guò)明顯活化Nrf2來(lái)降低Bax、PUMA 等促凋亡基因的表達(dá)，還可明顯上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而減少肝細(xì)胞的凋亡，改善由IRI 引起的肝臟組織病理學(xué)損傷［11］。黃芩甙是一種黃酮類化合物，具有較好的生物活性，WU 等［12］將黃芩苷暴露于缺氧/富氧（H/R）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞來(lái)模擬黃芩苷對(duì)肝IRI 的影響，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過(guò)調(diào)節(jié)KEAP1-Nrf2-ARE 信號(hào)傳導(dǎo)通路保護(hù)肝細(xì)胞免受H/R 誘導(dǎo)的氧化損傷，黃芩苷可顯著上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)并下調(diào)Bax 表達(dá)，減少H/R 刺激的肝細(xì)胞凋亡。

3 Nrf2相關(guān)通路在肝IRI中的作用

在肝IRI 中起作用的Nrf2 相關(guān)通路主要有KE?AP-Nrf2-ARE 通路、δ-阿片受體（DOR）-蛋白激酶C（PKC）-Nrf2 通路、沉默交配型信息調(diào)節(jié)2 同源基因1（Sirt1）-Nrf2 信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K-AKT）-Nrf2 通路、JAK 激酶（JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）-Nrf2 通路、Brahma 相關(guān)基因1（Brg1）-Nrf2通路等。

3.1 KEAP-Nrf2-ARE 通路 KEAP1 含有5 個(gè) 結(jié)構(gòu)域，其雙甘氨酸重復(fù)區(qū)是KEAP1 與Nrf2 的Neh2 的部位結(jié)合區(qū)。在正常條件下，Nrf2 位于與其抑制因子KEAP1相連的細(xì)胞質(zhì)中，KEAP1通過(guò)泛素化和蛋白酶體降解而抑制Nrf2 的轉(zhuǎn)錄活性［13］；應(yīng)激條件下Nrf2 可與KEAP1 解離，導(dǎo)致Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核，并與ARE 結(jié)合啟動(dòng)調(diào)節(jié)II 相代謝酶和抗氧化酶基因表達(dá)，如HO-1、SOD、GPx、NQO1 及γ-GCS 等［14］。越來(lái)越多的研究證實(shí)，KEAP-Nrf2-ARE 轉(zhuǎn)錄通路在體內(nèi)外對(duì)IRI 的保護(hù)中發(fā)揮重要作用。CHEN 等［15］用SD大鼠構(gòu)建了肝IRI 模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，肝IRI 組Nrf2、ARE、HO-1、NQO-1 等蛋白表達(dá)水平明顯增高，而與IRI 組相比，羅格列酮干預(yù)組Nrf2、ARE 等蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平明顯降低，肝組織病理?yè)p傷明顯好轉(zhuǎn)，充分印證了Nrf2/ARE 通路在肝IRI 中的保護(hù)作用。與之類似，常見(jiàn)抗氧化劑蘿卜硫素、西格列汀、西洛他唑等藥物也可通過(guò)激活Nrf2-ARE 信號(hào)通路來(lái)改善氧化應(yīng)激、減弱肝IRI［16-18］。黃芩苷是一種黃酮類化合物，被報(bào)道為Nrf2 信號(hào)的增強(qiáng)子。有研究表明，黃芩苷處理可顯著降低KEAP1 的表達(dá)，增加Nrf2 的表達(dá)，誘導(dǎo)HO-1和NQO1 的mRNA 表 達(dá)，進(jìn) 而減 輕 肝IRI［19］。LEE等［20］則通過(guò)構(gòu)建直接激活Nrf2-ARE 通路的轉(zhuǎn)基因模型證明了Nrf2-ARE通路過(guò)度激活對(duì)肝IRI的保護(hù)作用。

3.2 DOR-PKC-Nrf2 通路 PKC 是G 蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，其在細(xì)胞質(zhì)中可以激活三磷酸腺苷敏感的鉀離子通道，從而促進(jìn)鉀離子經(jīng)線粒體途徑流出，抑制鈣離子流動(dòng)，縮短動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間以及減少ATP 的消耗，提供器官保護(hù)作用［2］。有證據(jù)表明，活化的PKC 可調(diào)節(jié)Nrf2 Ser40 位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2 的轉(zhuǎn)位［21］。DOR 是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，在常氧狀態(tài)下，DOR 可通過(guò)激活PKC 依賴途徑進(jìn)而上調(diào)與抗氧化作用相關(guān)的Nrf2 靶向基因的表達(dá)。在缺血條件下，激活DOR 可降低KEAP1 mRNA 的表達(dá)，從而增加Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中的釋放，增強(qiáng)Nrf2 在細(xì)胞核中的功能［22］。有研究表明，［DAla2，D-Leu5］-腦啡肽可激活DOR-PKC-Nrf2 軸，促進(jìn)Nrf2 核易位和下游Ⅱ期代謝酶和抗氧化基因的表達(dá)，顯著降低血清中ALT 和AST 及肝勻漿中丙二醛的水平，升高肝勻漿中谷胱甘肽、過(guò)氧化氫酶和SOD 水平，被認(rèn)為是預(yù)防肝IRI 的一個(gè)潛在靶點(diǎn)［2］。CAO 等［22］則通過(guò)體外研究證實(shí)，DOR-PKC- Nrf2 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)缺氧—復(fù)氧肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。以上研究提示在肝缺血再灌注時(shí)，Nrf2 可能被通過(guò)DOR-PKC信號(hào)通路激活。

3.3 Sirt1-Nrf2 信號(hào)通路 Sirt1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的Ⅲ類核組蛋白去乙酰化酶［23］。Sirt1 是去乙酰化酶家族最重要的成員之一，可參與基因表達(dá)、代謝和氧化應(yīng)激等多種生理功能的調(diào)節(jié)［24］。當(dāng)Sirt1 觸發(fā)Nrf2 和KEPA1 的分離時(shí)，Nrf2 轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，Sirt1-Nrf2 信號(hào)可以激活某些抗氧化酶，改善細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。此外，Sirt1 在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Sirt1 基因可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB 的活動(dòng)，增加抗氧化基因表達(dá)，抑制炎癥［25］。輔酶Q10 是線粒體電子傳遞鏈的組成部分，MAH 等［26］發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10 可通過(guò)顯著激活Nrf2 蛋白恢復(fù)氧化與抗氧化平衡，同時(shí)可上調(diào)Sirt1 和FOXO-3 基因的表達(dá)，通過(guò)Sirt1-FOXO-3-Nrf2 信號(hào)通路顯著改善了IRI 損傷引起的肝臟功能障礙和氧化應(yīng)激，并且改善了IRI 引起的組織病理學(xué)損傷。有研究表明，金櫻子總黃酮（TFs）預(yù)處理可增加肝臟組織中Sirt1、總Nrf2、核Nrf2、HO-1、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）的水平，降低細(xì)胞質(zhì)Nrf2 的水平，表明TFs的抗IRI 作用可能是通過(guò)激活Sirt1-Nrf2-ARE 通路提高HO-1和GST蛋白水平，改善氧化應(yīng)激進(jìn)而減少肝細(xì)胞損傷［23］。證明Sirt1 可以激活Nrf2-ARE 信號(hào)通路來(lái)減輕肝IRI。

3.4 PI3K-AKT-Nrf2 通路 PI3K-AKT 軸是一種細(xì)胞存活通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。PI3K-AKT 信號(hào)級(jí)聯(lián)通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和凋亡，對(duì)IRI 具有很強(qiáng)的保護(hù)作用［27］。一旦PI3K 被激活，它可將磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸，進(jìn)而磷酸化并激活A(yù)KT［28］。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)外多種細(xì)胞刺激均有反應(yīng)，是生存信號(hào)的重要調(diào)控因子。激活的AKT 可促進(jìn)下游分子的磷酸化，包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白和Bcl-2，以抑制細(xì)胞凋亡［29］。除此之外，PI3K-AKT的級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)Nrf2 的激活具有正向影響。越來(lái)越多的證據(jù)表明，PI3K-AKT 信號(hào)通路對(duì)IRI 具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。CARINI 等［30］發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理后的肝細(xì)胞可激活PI3K 并調(diào)節(jié)蛋白激酶C 依賴的信號(hào)通路，提示PI3K在肝細(xì)胞耐缺氧中起重要作用。碲酸可誘導(dǎo)PI3K和AKT 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并可恢復(fù)IRI 的組織病理學(xué)變化，通過(guò)激活Nrf2 和PI3K/AKT 信號(hào)級(jí)聯(lián)，為肝IRI提供一種新的治療方向［14］。

3.5 JAK1-STAT-3-Nrf2 通路 JAK-STAT 信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路之一，除了可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡外，還可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在肝IRI 中發(fā)揮重要作用［31］。STAT-3 的表達(dá)異常不僅在腦、心、腎等多種器官的IR 損傷中起重要作用［32］，XIONG 等［33-34］研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟IRI 過(guò)程中，STAT-3表達(dá)和功能也顯著增強(qiáng)，進(jìn)而證實(shí)了STAT-3與肝臟IR 也密切相關(guān)。KAMEL 等［29］用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑培哚普利對(duì)肝IRI 大鼠進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)培哚普利可顯著降低JAK1/STAT-3 蛋白表達(dá)，可通過(guò)激活JAK1-STAT-3-Nrf2 信號(hào)通路，改善肝IRI 期間的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并明顯減少肝臟損傷。

3.6 Brg1-Nrf2 通路 Brahma 相關(guān)基因1（Brg1）是SWI/SNF 復(fù)合體的核心ATP 酶，是染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物的一個(gè)亞基，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因的激活和轉(zhuǎn)錄中起著核心作用，且在不同組織中干細(xì)胞的增殖、分化中發(fā)揮重要作用［35］。Brg1 可保護(hù)抗氧化防御基因啟動(dòng)子免受氧化損傷。有研究證明，肝IRI 可顯著增加氧化損傷，降低Brg1 的表達(dá)［36］。GE 等［35］用Brg1 過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)其進(jìn)行肝IRI 處理，發(fā)現(xiàn)IRI 早期Brg1 的表達(dá)被抑制，但再灌注時(shí)有所恢復(fù)，Brg1 在再灌注時(shí)的恢復(fù)可以增強(qiáng)Nrf2 介導(dǎo)的HO-1 的表達(dá)，從而有效提高抗氧化能力，對(duì)抗肝細(xì)胞損傷；在轉(zhuǎn)基因小鼠中，Brg1 的過(guò)表達(dá)可顯著降低肝IRI 的氧化應(yīng)激，同時(shí)該學(xué)者通過(guò)構(gòu)建缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型，從體外研究來(lái)驗(yàn)證Brg1 在肝IRI 中的作用；在Brg1 基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，Brg1 的過(guò)表達(dá)減弱了肝IRI 的氧化應(yīng)激水平，同時(shí)Nrf2 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，HO-1 誘導(dǎo)及啟動(dòng)子熒光素酶活性增強(qiáng)，而在Brg1 基因敲除細(xì)胞中，上述現(xiàn)象均不存在。一項(xiàng)關(guān)于Brg1 是否能減輕肝臟缺血再灌注所致肺損傷的研究表明，Brg1 的過(guò)表達(dá)可增加Nrf2 的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，并可激活抗氧化酶、降低炎癥因子的表達(dá)，從而減輕肝臟缺血再灌注誘導(dǎo)的肺氧化損傷［36］。

綜上所述，在肝缺血再灌注時(shí)，Nrf2 可通過(guò)抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等作用來(lái)減輕肝臟IRI。Nrf2 相關(guān)信號(hào)通路主要有KEAP-Nrf2-ARE 通路、DOR-PKC-Nrf2 通 路、Sirt1-Nrf2 信 號(hào) 通 路、PI3KAKT -Nrf2 通路、JAK-STAT-Nrf2 通路、Brg1-Nrf2 通路等，以上通路并非獨(dú)立，往往幾種信號(hào)通路相互交聯(lián)，共同參與抑制肝IRI。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Nrf2 對(duì)各種肝臟疾病具有保護(hù)作用，如膽汁淤滯性肝損傷、病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、藥物性肝損傷、肝IRI 和原發(fā)性肝臟惡性腫瘤等，越來(lái)越多的中醫(yī)藥也已被證實(shí)可通過(guò)Nrf2 改善肝IRI，然而，其激活Nrf2 的途徑減輕肝IRI 的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。通過(guò)激活Nrf2 來(lái)減輕肝IRI 可能是一種新的治療缺血性肝病的策略，其激活的作用機(jī)制及其作用底物尚有待進(jìn)一步研究，以Nrf2 為作用靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的藥物對(duì)于治療肝IRI 具有臨床指導(dǎo)意義，有望為臨床治療肝IRI尋找新的方案提供機(jī)遇。