血管新生與骨形成耦聯、骨骼疾病發生及治療中H型血管的作用機制研究進展

李高志，石菲，張舒，曹新生

空軍軍醫大學航空航天醫學系·航空航天醫學教育部重點實驗室，陜西西安710032

骨形成對于維持骨骼系統的完整性和功能性至關重要，骨形成障礙可導致多種骨骼疾病的發生，如骨質疏松癥、骨不連等［1］。血管新生包括血管發生和血管形成兩個過程。血管發生是指內皮祖細胞經募集、增殖、分化和遷移，形成功能尚不成熟的初級血管叢；血管形成是指從已存在的血管中生出新的血管［2］。在骨骼的生長發育及修復重建過程中，血管新生與骨形成有著緊密的時空聯系。在時間上，血管新生早于骨形成，并且血管入侵是骨形成及礦化的前提條件；在空間上，新生血管為骨組織提供必需的氧氣、營養物質和內分泌激素，而且能夠清除代謝廢物，同時作為骨與鄰近組織聯系的橋梁。血管新生與骨形成的這種緊密聯系被稱為“血管—成骨耦聯”［3］。

近年，隨著骨骼系統內H 型血管的發現，“血管—成骨耦聯”的內在分子機制得到進一步拓展。研究表明，H 型血管是一種與骨形成密切相關的毛細血管亞型，H 型血管內皮細胞能夠與多種骨骼細胞相互作用，從而實現血管新生與骨形成的耦聯［4-6］。此外，H 型血管廣泛參與骨質疏松癥、骨關節炎等多種骨骼疾病的發生發展，并有望作為上述疾病的治療靶點［7-8］。現將近年血管新生與骨形成耦聯中及骨骼疾病發生及治療中H型血管作用機制方面的文獻進行綜述。

1 骨內H型血管的特征

近年，RAMASAMY 等［5-6］根據內皮細胞的形態、表面標記物和功能特征將骨內微血管分為兩種亞型：H型和L型。其中，H型血管（即CD31hiEmcnhi）高表達血小板內皮細胞黏附分子-1（PECAM-1/CD31）和內皮黏蛋白（Emcn），主要位于干骺端和骨內膜，呈柱狀排列，并在生長板附近通過血管環或血管弓相互連接。L 型血管（即CD31loEmcnlo）表達低水平的CD31和Emcn，主要分布于骨干的骨髓腔，呈高度分支的毛細血管網。在干骺端與骨干交界處，L 型與H 型血管相互連接，構成一個連續的血管床。此外，與L 型血管相比，H 型血管周圍分布著大量的成骨譜系細胞。大部分Runt 相關轉錄因子2 陽性（Runx2+）的早期骨祖細胞、Osterix+骨祖細胞和I 型膠原陽性（Col1ɑ+）的成骨細胞與H 型血管直接相鄰，血小板源性生長因子受體陽性（PDGFRβ+）的間充質細胞也選擇性分布于H型血管周圍。進一步的研究表明，H 型血管能夠為骨代謝提供適宜的微環境，并通過旁分泌途徑調節血管周圍骨骼細胞的活性，使血管新生與骨形成相互耦聯。

2 在血管新生與骨形成耦聯中H型血管的作用機制

H 型血管新生與骨形成緊密耦聯是通過H 型血管內皮細胞與多種骨骼細胞之間的相互調控實現的。其中，破骨前體細胞、成骨細胞和軟骨細胞能夠分泌細胞因子促進H 型血管形成［4，9-10］；同時，H 型血管內皮細胞也可以分泌細胞因子促進骨形成［5-6］。這種相互調控依賴多種信號分子及通路的參與，如缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、Notch 信號通路、血小板源性生長因子-BB（PDGF-BB）、SLIT3和γ-干擾素誘導型單核細胞因子（CXCL9）等。

2.1 通過HIF-1 信號通路參與血管新生與骨形成耦聯 HIF-1是一種異源二聚體轉錄因子，由ɑ亞基和β 亞基組成，其中HIF-1ɑ 亞基是功能性亞基，決定HIF-1 的功能活性，并受到細胞內氧濃度的調節。在氧濃度>5%的富氧組織內，脯氨酰羥化酶（PHDs）和抑癌蛋白pVHL可以介導HIF-1ɑ蛋白通過泛素—蛋白酶體途徑降解。在低氧狀態下，HIF-1ɑ 不能被順利降解，從而與HIF-1β結合形成HIF-1，后者作為轉錄因子，能夠與基因序列中的低氧反應元件結合，反式激活下游靶基因，如血管內皮生長因子（VEGF）等，調節血管新生、組織修復等過程［11］。

近年研究表明，低氧信號通路在血管新生和骨形成的耦聯過程中發揮關鍵調控作用。KUSUMBE等［6］發現，在內皮細胞特異性敲除HIF-1ɑ 的轉基因小鼠中，可以觀察到脛骨干骺端和骨內膜部位的H型血管顯著減少，同時伴隨著骨量減少和骨祖細胞數目降低。相反，在內皮細胞中特異性敲除Vhl 基因后，觀察到H 型血管增多和新骨形成增強，并且Runx2+和Osterix+的骨祖細胞增多。此外，在給老齡小鼠補充外源性去鐵胺甲磺酸（DFM）（PHD 抑制劑，能夠增強HIF-1ɑ 活性）之后，小鼠表現為H 型血管增多和骨量增加［6］，而鐵蓄積狀態則會導致骨密度下降，同時骨內H 型血管的形成也受到顯著抑制［12］。這些結果提示低氧信號通路在“血管—成骨耦聯”過程中發揮重要作用。

2.2 通過Notch 信號通路參與血管新生與骨形成耦聯 Notch信號通路是一條在進化中高度保守的、依賴細胞間直接接觸的信號轉導通路。目前，在哺乳動物中發現4種Notch受體（Notch1、2、3、4）和5種Notch 配體（Dll1、3、4 以及Jagged1、2）。當Notch 受體與配體結合后，其胞內結構域脫落并進入細胞核，調節下游靶基因的表達，調控血管新生等過程［13］。

在大部分組織中，如小鼠腎臟、胚胎和腫瘤組織，Notch信號通路能夠通過限制內皮細胞出芽和增殖，負性調節血管新生［14］。然而，最近研究發現，在骨骼系統中，血管內皮細胞中的Notch 信號通路能夠正性調節血管新生與骨形成［5，15-16］。在內皮細胞特異性敲除Notch 信號的轉基因小鼠中，可以觀察到脛骨組織內H型血管含量降低，柱狀結構紊亂，血管內皮細胞的絲狀偽足連續性中斷；小鼠的股骨長度縮短，干骺端結構破壞，松質骨體積減少；轉基因小鼠的生長板區域發生畸形，軟骨細胞區擴大，能夠促進軟骨細胞分化的SOX9 表達降低，并且肥大軟骨細胞產生的VEGF 顯著減少。進一步研究發現，上述這些骨骼缺陷與內皮細胞分泌的Noggin 蛋白減少有關。在Notch 信號失活的轉基因小鼠中補充外源性重組Noggin 蛋白，能夠恢復干骺端的組織結構和骨祖細胞的數目，促進骨形成，同時恢復血管的完整性［5］。在此基礎上，FU 等［15］發現，鋅指轉錄因子ZEB1 在H 型血管中高度表達，其與CBP/p300 結合形成復合物，能夠提高Dll4 和Notch1 基因啟動子區的組蛋白乙酰化水平，從而激活Notch 信號通路，促進內皮細胞分泌多種細胞因子，如Noggin、轉化生長因子-β（TGFβs）、骨形成蛋白（BMPs）等，進而促進骨形成。還有研究表明，非編碼RNA 可通過調控Notch 信號通路影響骨骼的血管新生與骨形成。YANG等［17］發現，miR-497～195在H型內皮細胞中高度表達，并分別激活內皮細胞中Notch 和HIF-1 信號通路，正性調節血管新生與骨形成。上述這些結果提示，Notch信號通路及其上游信號分子在調控H型血管新生與骨形成的耦聯過程中發揮重要作用。

2.3 通過PDGF-BB 參與血管新生與骨形成耦聯PDGF-BB 屬于PDGF 家族，其能夠與內皮祖細胞和間充質干細胞表面的PDGFRβ結合，啟動PI3K-AKT信號通路，調節其增殖、分化和遷移過程，從而調控血管新生與骨形成［18-19］。最近，XIE 等［9］發現，在骨形成和重建過程中，破骨前體細胞分泌的PDGF-BB能夠誘導H 型血管形成，進而促進骨形成。GAO等［20］發現，巨噬細胞在骨形成過程中可以分化成為抗酒石酸磷酸酶陽性的單核細胞，并分泌PDGFBB，誘導骨膜來源細胞（PDC）表達周蛋白，同時募集PDC 至骨膜表面，促進皮質骨形成和H 型血管新生。PENG 等［21］研究表明，糖皮質激素能夠抑制破骨前體細胞中NF-κB 信號通路，減少PDGF-BB 表達與分泌，導致H 型血管減少，造成骨形成速率降低、骨量減少。此外，還有研究發現，荷葉堿通過抑制MAPK 和NF-κB 信號通路，阻斷單核的破骨前體細胞融合為多核的成熟破骨細胞，從而維持破骨前體細胞的數目，并促進其分泌PDGF-BB，最終增強H型血管新生與骨形成［22］。這些結果表明，破骨前體細胞分泌的PDGF-BB 是調控H 型血管新生與骨形成的重要信號分子。

2.4 通過SLIT3 參與血管新生與骨形成耦聯SLIT3 是SLIT 蛋白家族的成員之一，其最初發現于中樞神經系統，是一種在進化上高度保守的分泌型糖蛋白，通過與靶細胞表面的跨膜受體ROBO（Roundabout）蛋白家族結合，調節神經元前體細胞的遷移和神經軸突的定向生長［23］。除此之外，SLIT3蛋白也在其他組織中表達，并參與調節血管新生等過程［24］。

近年研究表明，SLIT3 在“血管—成骨耦聯”過程中發揮重要調控作用。XU 等［4］發現，在骨骼系統內，成骨細胞來源的SLIT3 通過與H 型血管內皮細胞表面的ROBO1 受體結合，誘導H 型血管新生，進而促進骨形成。隨后通過建立骨折和絕經后骨質疏松的動物模型，進一步證實SLIT3 是調節H 型血管新生與骨形成的關鍵因子，并有望作為促進骨折愈合、治療骨質疏松的新靶點。

2.5 通過CXCL9 參與血管新生與骨形成耦聯CXCL9 是趨化因子CXC 家族的一員，通常與其受體CXCR3 結合，激活下游信號通路并發揮調節功能。最近，HUANG 等［25］發現，在骨形成和重建過程中，成骨細胞可以持續性分泌CXCL9，后者能夠與VEGF相互結合，并阻止VEGF識別內皮細胞表面的受體，最終抑制H型血管新生與骨形成。

3 多種骨骼疾病發生及治療中H型血管的作用機制

H 型血管在“血管-成骨耦聯”中的重要作用日益引發臨床醫學工作者的關注。近年研究發現，H型血管在骨質疏松癥、骨關節炎等多種骨骼疾病中表現出異常的形態特點，并參與上述骨骼疾病的發生發展。此外，H 型血管調控骨形成的相關信號分子及通路也為骨骼疾病的治療提供了新的干預靶點。目前，針對H 型血管的靶向藥物已經在多種動物模型中獲得了積極的治療效果，對于將來的臨床應用有一定的借鑒意義。

3.1 骨質疏松癥發生及治療中H 型血管的作用機制 骨質疏松癥是人類最常見的骨骼疾病，其主要特點是骨密度降低、骨微結構改變，同時骨骼脆性增強，使患者發生脆性骨折的風險升高。老齡和雌激素水平降低是骨質疏松癥的主要危險因素。研究發現，老齡小鼠和去卵巢小鼠在發生骨質疏松的同時，骨內H 型血管內皮細胞、骨祖細胞和成骨細胞數目均顯著減少［6，9］。同時，多項研究表明人類骨骼中也存在H 型血管，并且H 型血管的含量與骨密度具有正相關性。因此，H 型血管可以作為人類衰老和骨質丟失的生物標志物［7］。不僅如此，H 型血管的發現也為治療骨質疏松提供了新的靶點。研究發現，在老齡和去卵巢小鼠中補充DFM 能夠提高骨內H型血管的含量，促進脛骨和股骨的骨量增加，骨祖細胞的數目增多［6］。此外，在骨質疏松小鼠中補充一些小分子藥物，如肉葉蕓香堿和荷葉堿，能夠促進破骨前體細胞表達PDGF-BB，從而誘導H 型血管新生，促進新骨形成［22］。另外，一些非編碼RNA 的生物制劑，如aptamer-agomiR-195 和microRNA-136-3p Agomir，也能夠顯著緩解骨質疏松小鼠內H 型血管的減少與骨丟失［17］。

3.2 骨關節炎發生及治療中H 型血管的作用機制 骨關節炎是常見的關節疾病，其病理特點主要包括進行性軟骨退變、軟骨下骨硬化、軟骨下骨血管侵犯等。研究發現，在骨關節炎發生過程中，軟骨下骨中的H 型血管含量增多，后者能夠促進軟骨下骨形成及重塑。此外，軟骨細胞對軟骨下H 型血管的正反饋調節進一步促進了骨關節炎的發展。研究發現，雷帕霉素靶蛋白復合體1（mTORC1）在關節軟骨細胞中的過度激活會促進其分泌VEGF，從而誘導軟骨下骨中H 型血管的形成，而新生血管又會刺激軟骨細胞表達VEGF，進一步導致軟骨下骨中H 型血管形成，最終引起軟骨下骨形成。因此，抑制軟骨細胞中mTORC1的活性能夠降低軟骨下H型血管的含量，緩解骨關節炎的進展［8］。另外，一些小分子藥物，如常山酮和青蒿琥酯，也能夠抑制軟骨下H型血管形成，減輕關節軟骨退變和軟骨下骨硬化。

3.3 肌腱端病發生及治療中H 型血管作用機制肌腱端，又稱為起止點，是肌腱、韌帶或筋膜附著于骨骼的部位。肌腱端病的主要病理特點是纖維軟骨退變、骨壞死和過度的血管新生。WANG 等采用3種肌腱端病動物模型開展研究，發現TGF-β 的過度激活是引起異常骨形成和血管新生的重要因素。高濃度的活性TGF-β 能夠募集間充質干細胞，并引起H 型血管新生、纖維軟骨鈣化和骨骼重塑。此外，在小鼠模型中，通過注射TGF-β 的中和抗體來抑制TGF-β 的活性，能夠減輕過度的血管形成并恢復異常的骨骼重塑。

3.4 異位骨化癥發生及治療中H 型血管的作用機制 異位骨化癥是指在骨骼系統以外形成新生骨。研究發現，在異位骨化癥的發生過程中，新生骨中H型血管含量增加，后者進一步引起新骨形成。TGFβ 的過度激活能夠募集間充質干細胞，并引起H 型血管過度新生。此外，在異位骨化癥的小鼠模型中，通過注射TGF-β 的中和抗體來抑制TGF-β 的活性，能夠延緩異位骨化癥的進展。另外，在異位骨化癥小鼠模型的間充質干細胞中特異性敲除TGF-β 受體，同樣能夠抑制異位骨化癥的進展。

3.5 骨缺損修復中H 型血管的作用機制 H 型血管與骨缺損的修復過程密切相關。形態學研究發現，在大鼠脛骨骨缺損修復的中晚期，H 型血管選擇性地分布于生長區域的骨小梁周圍，促進新骨形成與骨重建。另外，通過使用促進H 型血管形成的小分子藥物，可顯著改善動物的骨缺損修復過程，如在骨折小鼠中應用麥冬皂甙D 或重組SLIT3 蛋白，均能夠顯著提高小鼠骨折部位的H 型血管含量，加速骨折愈合［4］。此外，采用一些生物材料，如Ca-P-Mg支架和含有生物活性分子的超臨界CO2泡沫復合支架，誘導大鼠顱骨骨缺損部位的H型血管形成，結果促進了顱骨的修復與再生。

綜上所述，H 型血管是一種特殊的骨組織毛細血管亞型，能夠與成骨細胞、破骨前體細胞、軟骨細胞和骨祖細胞建立復雜的調控網絡，使得血管新生與骨形成在骨骼發育及修復重建過程中實現相互耦聯；其調控機制涉及HIF-1 信號通路、Notch 信號通路、PDGF-BB、SLIT3 和CXCL9 等多種細胞因子及信號通路。此外，H 型血管與骨質疏松癥、骨關節炎等骨骼疾病的發生發展密切相關，其相應表現和作用機制已經得到初步闡明，針對H 型血管的靶向藥物也在上述疾病的動物模型中獲得了積極的治療效果。未來，對H 型血管的深入研究將進一步加深對“血管—成骨耦聯”分子機制的理解，并有望為骨骼疾病的診治提供新的思路。