間充質干細胞在克羅恩病治療中的應用研究進展

張義寶，鐘繼紅

1 浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江杭州310053；2 浙江中醫藥大學附屬第二醫院

克羅恩病（Crohn’s disease，CD）是炎癥性腸病的一個亞型，主要病理特征為消化道黏膜跳躍性病變、透壁性炎癥及非干酪性肉芽腫［1］。近年來，我國CD 發病率呈增長趨勢，15～25 歲青壯年好發，主要臨床表現為腹痛、腹部包塊、腹瀉、體質量下降等，部分患者可出現皮膚、關節病變及貧血等；此外，以肛周瘺管為首發癥狀的CD 患者逐漸增多，病情嚴重的患者會出現肛周疼痛、肛周瘺管膿性分泌物滲出、大便失禁等癥狀，嚴重影響患者生活質量［2］。目前，CD 的發病機制尚未統一，但多數研究認為CD 的發病主要與遺傳、環境、感染、腸道菌群及免疫等因素有關。環境因素造成遺傳易感群體在腸道菌群介導中出現腸道異常免疫應答，使腸道出現免疫侵損與炎癥發生發展的過程，亦由于患者免疫調節失衡和（或）持續性受到特異抗原調控，最終導致CD［3］。目前臨床尚無特異性CD根治方法，主要采用5-氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑和生物制劑等藥物控制疾病活動，延緩疾病進展。但隨著患者疾病活動度的進展，藥物治療的效果減弱，患者易出現過敏、耐藥等不良反應。尋找新的CD 治療方案具有重要臨床意義。最新研究發現，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治療 CD 具有一定效果，但其具體治療機制、療效及安全性不明。現重點將MSCs在CD治療中的應用情況綜述如下。

1 MSCs的生物學功能

MSCs 具備自我更新、多向分化與免疫調節性能，可作為促進組織再生的關鍵種子細胞，定向分化成成骨、軟骨、內皮、脂肪等不同功能組織細胞［4］。由于MSCs生物特征多樣性，MSCs可用于組織修復、再生、抑制物預防宿主病、自身免疫性疾病、抗炎癥治療等方面。

1.1 MSCs的極化 炎癥狀態下的微環境差異可介導 MSCs 發生極化，并且與 M1 型、M2 型巨噬細胞雷同。MSCs 極化后分為促炎型MSC1 與抗炎型MSC2。組織侵損時侵損部位可大量分泌炎癥因子，介導巨噬細胞分化為M1 型巨噬細胞，加重炎癥反應，大量分泌干擾素γ（INF-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子，導致MSCs 分化為抗炎型MSC2，調控一氧化氮、吲哚胺2，3-雙加氧酶的產生，發揮抗炎作用，降低組織損傷程度［5-6］。MSCs 極化后具有抑制與增強免疫的雙重效果。將MSC1 與腫瘤細胞共同培養時，MSC1 可抑制腫瘤細胞的增殖、降低腫瘤細胞遷移，而MSC2 可促進腫瘤細胞的生長與增殖［7-8］。

1.2 MSCs的歸巢 干細胞“巢”作為干細胞生存的微環境，可介導干細胞的生物學行為，維持干細胞生長、分化與更新平衡性。MSCs 歸巢是MSCs 在血管內皮管壁中游離，并粘附在內皮細胞表層中，受血管內皮影響而穿透內皮細胞達到目標靶組織［9］。MSCs歸巢數目量對組織增殖、凋亡、遷移影響明顯，但具體作用機制目前尚不明確。有研究［10］推測，MSCs 歸巢可能與MSCs 表面表達的趨化因子、黏附分子及生長因子等因素有關。目前由于轉基因技術的不斷發展，強調可將病毒或質粒作為載體攜帶有益基因提高MSCs的歸巢效率和治療能力。

2 MSCs在CD治療中的應用

2.1 MSCs 治療 CD 的作用機制 MSCs 治療 CD 的作用機制可能與免疫調節、極化、歸巢、TLRs受體激活、組織修復與免疫原性低下等因素有關。

MSCs 的免疫作用是多環節共同作用的結果，MSCs 可通過調節干擾素、TNF-α、白細胞介素6（IL-6）等炎癥信號通路極化從而抑制炎癥反應。極化的MSCs 可分泌大量免疫抑制可溶性因子調控T、B 細胞的分裂復制分化，影響肥大細胞的活化，延緩樹突狀細胞成熟聚集Treg 細胞，讓未成熟的樹突細胞發生轉為調節性樹突細胞，使炎性M1 型巨噬細胞轉化成為免疫調節作用的M2型巨噬細胞。MSCs能分泌胞外囊泡（EVs），有研究［11］報道，MSCs 外囊泡（MSC-EVs）具有與MSCs類似的免疫調節功能，它能促進單核細胞分化為M2型巨噬細胞，抑制T細胞的激活、增殖，降低細胞因子的產生，從而更有利于MSCs發揮免疫調節作用。MSCs還可大量分泌具有細胞交流作用的外泌體，促進淋巴細胞形成、炎癥因子活化釋放，發揮對異常免疫系統的調節作用。體外研究［12］發現，MSC 的表型及功能在治療 CD 時不受普通藥物濃度影響，MSC 聯合常規調節免疫藥物、抗炎藥物治療CD 效果更好。此外，CD 患者TLRs受體的激活有利于維持慢性炎癥狀態，同時也作用影響MSCs 免疫調節、極化、歸巢功能，有利于充分發揮MSCs 治療效果。令人感到意外的是，凋亡的MSCs也具有免疫抑制作用［13］。

MSCs在游離遷移時可修復損傷的腸道組織，作用分化為腸上皮肌成纖維細胞，大量分泌修復因子促進腸上皮細胞的增殖、分化，而保護腸道黏膜。

2.2 用于CD 治療的MSCs 來源 目前用于CD 治療的MSCs 主要來源于脂肪組織、骨髓及臍帶血。與骨髓間充質干細胞比較，脂肪組織、臍帶血中的MSCs免疫抑制功能更強。脂肪源性MSCs具有最低的免疫原性［14］，由于CD 患者IL-1β 分泌使腸系膜脂肪源性干細胞免疫抑制特性降低，激活了脂肪源性干細胞的免疫反應，因此具有最佳免疫抑制作用的脂肪源性MSCs 可能是治療CD 患者的最好選擇。歐盟批準的異體擴大脂肪源性MSCs 是首個用于治療非活動性或輕度活動性腔內CD 成年患者復雜肛瘺的 MSCs 療法［15］，該源性 MSCs 療效和安全性在多個臨床試驗中得到了驗證。無論是自體還是同種異體的 MSCs 均對 CD 有一定的療效，但有研究［16］報道在利用MSCs 治療49 例CD 患者中，同種異體MSCs治療比自體MSCs 治療效果更好。自體MSCs 在潰瘍性結腸炎、CD及系統性紅斑狼瘡治療中的效果有待提高，可能與同種異體的MSCs 穩定性更好有關，且由于MSCs只低水平表達HLA I類抗原，而缺乏表達HLA II 類抗原，因此同種異體MSCs 移植時并不需要考慮免疫排斥反應，這使同種異體MSCs 應用范圍更加廣泛。除了以上三種主要來源的MSCs，Zibandeh 等［17］體外研究報道了人牙濾泡間充質干細胞（DF-MSCs）能顯著減少 CD 患者炎癥組織 T 細胞數量，誘導產生Tregs，降低免疫反應，這為MSCs 治療CD提供了一個重要的潛在來源。

2.3 MSCs用于治療CD的適應證、禁忌證 歐洲血管和骨髓移植組歸納的MSCs 在自身免疫性疾病中的常見適應證為多發性硬化癥、系統性硬化癥及CD［18］。MSCs 適用于糖皮質激素、免疫抑制劑與生物制劑等治療效果有限時的重癥克羅恩病或合并肛瘺者，尤其是對于復雜難治性肛瘺CD 患者，MSCs治療是一種很有前景的方法。手術治療或具有手術禁忌證患者并不適用于MSCs 治療。應用MSCs 治療前需判斷CD 的疾病狀態，同時應注意患者出現腹腔、盆腔膿腫或其他感染的可能。

2.4 MSCs 用于治療CD 時劑量 目前，臨床對MSCs 治療CD 的劑量與療程沒有統一標準。Dhere等［19］利用自體骨髓 MSCs 在 12 名克羅恩病患者中進行首個Ⅰ期安全臨床試驗，設置了2、5 或1000 萬個細胞/kg 的輸注梯度，發現所有患者耐受性良好，未見劑量依賴毒性，單次靜脈注射劑量1000萬細胞/kg是安全可行的。ALVARO-GRACIA 等［20］研究發現，初始治療時劑量為2 000萬單位MSCs時，CD合并肛瘺患者體內未觀察到臨床應答，治療8 周時再次追加劑量2 000 萬，最終患者肛瘺封閉，但此次應用計量涉及樣本量較小，尚缺乏多中心大樣本驗證。

2.5 MSCs用于治療CD 時的應用方式 MSCs 治療CD方式有靜脈輸注、局部注射、腸系膜上動脈注射、股動脈注射等。靜脈輸注是現階段抑制MSCs 的最理想方式，尤其是針對CD 合并肛瘺、直腸陰道瘺的患者，可便于MSCs 在可吸收基質中附著，促進對病灶組織的修復作用，且操作便捷；腸系膜上動脈注射、股動脈注射等均為有創性操作，增加感染及并發癥風險；局部注射單純針對局部位置的病灶具有良好效果，但治療全身性炎癥效果一般。在局部輸注MSCs治療肛瘺CD 時，MOLENDIJK 等［21］強調為了避免MSCs 的浪費，達到規范化治療目的，應將MSCs注射至瘺管內部開口周圍的管壁而非瘺管腔內。因MSCs 注射后會被肺部吸收，造成CD 腸道炎癥位置可吸收劑量減弱，所以對治療效果有一定的影響。孫輝等［22］對潰瘍性結腸炎小鼠采用不同注射MSCs方式治療，然后發現心臟注射模式治療效果優于尾靜脈注射；DAVE 等［23］利用超聲將人骨髓 MSCs 從左心室注入CD 小鼠體內，提高了MSCs 輸往炎癥部位的成功率，極大地降低了小鼠發病率和死亡率。但此方式對臨床患者治療方式的選擇而言僅具有一定參考價值，并不適用。

2.6 MSCs 治療CD 的療效和安全性 不論是體外研究還是臨床Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期試驗均表明MSCs治療CD療效較好。XIE 等［24］體外研究結果顯示脂肪源性MSCs和骨髓源性MSCs均能提高CD小鼠IL-10的表達，減少炎癥因子生成，抑制炎癥反應，兩者療效類似。MSCs不僅對活動性CD有效，還對CD相關性腸纖維化起作用。LIAN 等［25］體外研究報道了骨髓MSCs通過免疫調節作用能夠治療CD小鼠腸道纖維化，降低腸道梗阻的發生率。

在最近幾年的Ⅰ期臨床試驗中，證實MSCs 治療CD 合并肛周瘺管患者是安全有效，DOZOIS 等［27］和 LIGHTNER，AMY L 等［28］人分別報 道 了自體MSCs對經括約肌隱腺瘺和直腸陰道瘺CD患者治療安全有效［27-28］。在Ⅱ期臨床試驗中，GREGOIRE等［29］表明 MSCs 治療腔內 CD 在短期是安全有效，但為了更好地設計臨床試驗，后續還需要更多的體外試驗。在更高級別的Ⅲ期臨床試驗中，PANéS 等［30］完成的一項3 期多中心隨機雙盲對照臨床研究有力證明了異體擴大脂肪來源的間充質干細胞（Cx601）治療肛周瘺管CD 是有效和安全的。此外GARCIAOLMO 等［31］人 完 成 異 體 擴 大 脂 肪 來 源 的 MSCs（Cx601）治療CD 患者復雜肛瘺的3 期臨床試驗后，又同樣利用Cx601 治療CD 患者復雜肛瘺進行了另外一項臨床試驗，不同的是此次臨床研究將觀察時間延長至第52周，與標準治療相比，Cx601治療效果更佳，至第52周時患者復發率更低。在最高級別的研究證據中，國內外多位學者［32-35］在不同年份對MSCs 治療肛瘺CD 患者進行了META 分析，均證實MSCs對肛瘺CD患者有效，無與MSCs直接相關的不良事件增加，且無論是自體還是同種異體MSCs 移植，脂肪、骨髓、胎盤來源的MSCs 治療CD 肛瘺均安全有效，與骨髓間充質干細胞相比，脂肪間充質干細胞具有更低的復發風險。

上述研究均只是單純應用MSCs 治療CD，目前有許多研究證實MSCs 聯合其他治療方式會增強療效。抗細胞因子藥物聯合骨髓MSCs 治療有助于減少CD 患者單純肛瘺復發率，延長瘺管持續關閉時間［26-37］，并且 KNYAZEV 等［38］還報道了硫唑嘌呤（AZA）聯合骨髓MSCs 治療CD 具有更強的抗炎作用。WAINSTEIN 等［39］人的長期隨訪研究表明脂肪MSCs 聯合富血小板血漿及直腸內推進皮瓣對復雜肛瘺CD 具有較好治療效果。因此在臨床上可以適當聯合抗細胞因子、硫唑嘌呤等制劑治療CD患者。

總體認為，MSCs治療CD短期內具有安全性，幾乎未見不良反應或嚴重不良反應，但長期臨床安全性由于研究數據不足所以難以定論，這需要未來長期隨訪研究。目前最長的研究周期為BARNHOORN等［40］為期4 年的臨床研究，結果表明同種異體骨髓MSCs治療肛瘺CD患者長期安全有效。因干細胞中具備活化癌基因細胞的腫瘤特征，同時在細胞傳代期間具有分化風險，所以MSCs 移植后存在誘發腫瘤的危險。但有研究［41-42］指出，MSCs 移植后患者會在短時間中出現低熱的情況，但并未觀察到組織異位增生存在，而現有臨床資料中也并未有CD 患者采用MSCs治療后并發腫瘤的案例報道。

綜上所述，MSCs移植治療可延緩CD病情進展，改善患者生活質量，促進腸黏膜的恢復，且幾乎未見不良事件。但由于MSCs 治療CD 仍然在試驗階段，尚需多中心、大樣本、隨機雙盲研究，現階段仍有一些問題丞待解決，如MSCs最理想來源、CD患者適應證，最理想移植方式、治療次數及療程、治療后腸道菌群變化、治療后無效如何處理、治療后病情復發或加重是否繼續維持MSCs 治療等等都需在日后臨床試驗中深入探討。