川崎病患兒差異表達基因篩選及相應(yīng)蛋白表達觀察

崔曉鳴，劉力，張博

1天津市兒童醫(yī)院天津大學兒童醫(yī)院檢驗科，天津 300074；2天津市兒童醫(yī)院天津大學兒童醫(yī)院風濕免疫科；3天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系；4天津市細胞與分子免疫重點實驗室

川崎病（Kawasaki disease，KD）是由日本學者Tomisaku Kawasaki首次報道發(fā)現(xiàn)的一種皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征［1］。KD好發(fā)于5歲以下兒童，主要臨床表現(xiàn)為急性發(fā)熱、皮疹、黏膜血管炎、肝脾淋巴結(jié)腫大等［2］。KD被列為急性兒童血管性疾病，可導致兒童獲得性心臟冠狀動脈病變（Coronary artery lesion，CAL），主要包括冠狀動脈擴張、冠狀動脈瘤、冠狀動脈狹窄、冠狀動脈瘺形成等，癥狀嚴重者可出現(xiàn)心肌梗死及缺血性心肌病，甚至猝死。KD目前已經(jīng)是發(fā)達、發(fā)展中國家兒童最常見的獲得性心臟病的病因［3-4］。目前KD的治療方法為早期大劑量靜脈注射免疫球蛋白（Intravenous Immunoglobulin，IVIG）聯(lián)合阿司匹林［5］。KD的病因目前尚不明確，具有感染、環(huán)境污染及過敏等多個假設(shè)［6］。早診斷、早期干預是KD治療的關(guān)鍵，但目前臨床尚缺少KD診斷的“金標準”。我們運用生物信息學方法分析川崎病（KD）患兒差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），并觀察KD患兒血清中相應(yīng)DEGs蛋白的表達變化，現(xiàn)將結(jié)果報告如下：

1 資料與方法

1.1 KD患兒及健康兒童DEGs篩選

1.1.1 數(shù)據(jù)來源 KD基因測序數(shù)據(jù)來源于Yu Rang Park創(chuàng)建的KD數(shù)據(jù)庫（Kawasaki Disease Database，KDD）［7］。作為首個公共數(shù)據(jù)庫，KDD包括了亞洲范圍內(nèi)1 283例兒童病例的1 292個標本臨床數(shù)據(jù)和相應(yīng)基因組數(shù)據(jù)。

1.1.2 KD患兒及健康兒童DEGs篩選 通過R軟件中edgeR軟件包在納入基因組中篩選KD患兒及健康兒童DEGs以對數(shù)轉(zhuǎn)換的差異表達倍數(shù)（Log2FC）的絕對值＞1和P＜0.05為條件進行篩選［8］。繪制DEGs的火山圖譜，一個點代表一個基因，紅色點代表基因表達上調(diào)，綠色點代表基因表達下調(diào)，黑色小方塊表示基因沒有顯著差異變化；橫軸表示差異表達的倍數(shù)，縱軸表示-Log10（錯誤發(fā)現(xiàn)率）。

1.2 KD患兒及健康兒童外周血中基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP-8）、嗅介蛋白-4蛋白（OLFM4）蛋白水平檢測

1.2.1 臨床資料 選擇我院2017年7月—2020年7月間收治的典型KD患兒40例。根據(jù)2017年美國心臟協(xié)會新版《科學聲明》，具備以下6項臨床表現(xiàn)中的至少5項：①持續(xù)發(fā)熱≥5 d；②多形性皮疹；③口腔黏膜彌漫充血，楊莓舌，口唇充血皸裂；④急性非化膿性頸部淋巴結(jié)腫大，通常直徑＞1.5 cm；⑤非滲出性雙眼球結(jié)膜充血；⑥肢端變化，急性期掌趾紅斑，手足硬性水腫，恢復期膜狀脫皮。如果患者僅具備上述主要癥狀中的4項，但超聲心動圖或冠狀動脈血管造影證實有CAA或擴張時，也可診斷為典型KD。根據(jù)此標準，最終入組40例。另選擇15例健康兒童為對照，排除血液疾病、免疫系統(tǒng)疾病及感染性疾病者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準同意，納入者家屬均知情同意。。

1.2.2 KD患兒及健康兒童外周血MMP-8、OLFM4蛋白水平檢測 因“1.1”得到的DEGs中MMP-8、OLFM4基因差異最為明顯，最終采用ELISA雙抗體夾心法檢測KD患兒及健康兒童外周血MMP-8、OLFM4，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行（試劑盒選自Abcam公司）。為了減少待測人群凍存后細胞數(shù)量和檢測因子受損嚴重情況，影響指標檢測，本項目樣本采用新鮮提取的外周血，分批次對待測人群進行檢驗，最終的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)一整理。標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100 mL，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液（PBS）50μL，混勻；以此類推，逐步稀釋，最終稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為24、16、8、4和2μg/L；加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外。進一步溫育和洗滌。顯色：每孔先加入50μL顯色劑A，再加入50μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。測定。以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的光密度OD值。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進行。實驗獨立重復3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Excel 2013軟件建立數(shù)據(jù)庫，SAS 9.4和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。對連續(xù)性變量進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的變量以±s表示，采用SAS 9.4中的T test方法用于數(shù)據(jù)比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KD患兒及健康兒童DEGs篩選結(jié)果 與健康兒 童 相 比，KD患 兒 有MMP-8、OLFM4、OLAH、CD177、RETN、CEACAM8、LCN、LTF、ARG1以及HP基因等288個DEGs，其中表達上調(diào)186個、表達下調(diào)102個。在此其中，MMP-8和OLFM4差異最為明顯（P均＜0.05）。

2.2 KD患兒及健康兒童外周血MMP-8、OLFM4表達蛋白水平比較 KD患兒外周血MMP-8、OLFM4表達水平分別為（73.21±13.66）、（26.37±5.88）ng/mL，健康兒童分別為（46.32±9.38）、（9.37±5.23）ng/mL，二者比較，P均＜0.05。

3 討論

KD，是一種不明原因的急性自限性發(fā)熱性疾病。目前關(guān)于KD的病因及發(fā)病機制尚不明確，包括肺炎支原體、化膿性鏈球菌、皰疹病毒、輪狀病毒在內(nèi)的多種感染均有可能引發(fā)此類疾病［9］。與此同時，近期發(fā)現(xiàn)遺傳因素在KD形成中也可能發(fā)揮重要作用。一些研究［10］結(jié)果表明，KD存在某些易感性的遺傳因素，其中包括：同卵雙胞胎患KD的風險在13%左右；有KD病史的父母后代KD發(fā)生率增加，以及受影響患者的兄弟姐妹中KD的發(fā)生率增加。全基因組分析發(fā)現(xiàn)多個基因的多態(tài)性與KD發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在家族連鎖和基因組關(guān)聯(lián)研究中，不同基因和基因區(qū)域的多個單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）已被證實，這其中包括：Caspase-3（CASP3）、肌醇1，4，5-三磷酸激酶c（ITPKC）、CD40、FCGR2a和b以及細胞淋巴激酶（BLK）［11，12］。許多與KD相關(guān)的SNPs在其他炎癥性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、紅斑性狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥中也有發(fā)現(xiàn)。以上研究結(jié)果均證實炎癥免疫反應(yīng)在這些疾病的發(fā)生發(fā)展中可發(fā)揮重要作用。

盡早發(fā)現(xiàn)和及時干預是KD臨床治療的關(guān)鍵。未經(jīng)及時治療的KD患者發(fā)生冠狀動脈病變的概率在25%左右，也是兒童獲得性心臟病最常見的病因［13，14］。KD與自身免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，但具體機制尚不清楚。迄今為止，盡管對細菌毒素、超級抗原、真菌有機體和病毒性病原體進行了許多研究，但還沒有發(fā)現(xiàn)任何潛在的感染原因。然而，主流學派仍然堅持：未知的刺激引發(fā)了炎癥級聯(lián)反應(yīng)，激活了免疫系統(tǒng)固有的和適應(yīng)性的免疫應(yīng)答，最終導致KD的發(fā)生。與此同時，KD最終形成還需要先天免疫系統(tǒng)通過檢測病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）來激活［15］。

在KD的急性期，循環(huán)促炎性和調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量似乎有所增加。研究表明，KD患者的組織和冠狀動脈血管壁中產(chǎn)生IgA的漿細胞數(shù)量有顯著的增加。本研究中也發(fā)現(xiàn)，Macrophages M1和T cells CD8兩類細胞在KD患者組中存在顯著差異性。Macrophages異常表達普遍發(fā)生于KD患者。巨噬細胞活化綜合征（Macrophage activation syndrome，MAS）相關(guān)聯(lián)的KD患者近年來也逐漸見諸報道［16，17］。T cells CD8與KD的研究尚未全面展開，值得進一步深入研究。IVIG是針對KD患者目前臨床推薦的主要治療方式。施用IVIG后，患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細胞群和B細胞激活因子的正常化。所有上述發(fā)現(xiàn)都支持適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在KD中的重要作用。但具體那個免疫分子發(fā)揮更重要的作用，尚需進一步研究。

目前針對KD缺乏有效的臨床標志物。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-8和OLFM4在KD患者存在顯著性高表達，并且可以在臨床檢驗中得到證實。MMP是一種鋅依賴性明膠酶。MMP蛋白家族參與自身免疫功能調(diào)節(jié)，可以降低細胞外基質(zhì)蛋白的表達進而影響免疫細胞的轉(zhuǎn)移［18］。MMP-9（MMP家族中另一個重要蛋白成員）可以作為兒童嚴重膿毒癥（一種免疫系統(tǒng)相關(guān)常見疾病）的潛在臨床標志物［19，20］。在該研究中，與健康對照相比，嚴重膿毒癥患者的血漿MMP-9水平在第1天顯著升高。但是值得注意的是，成人膿毒癥和兒童膿毒癥患者中測量MMP-9的水平不盡相同。MMP-9在膿毒癥和KD中的作用可能與其在基底膜中裂解膠原蛋白的功能密切相關(guān)有關(guān)。該過程可以促進白細胞和淋巴細胞能夠進出外周循環(huán)。OLFM4是一種分泌型糖蛋白，標志著中性粒細胞的一個子集。

OLFM4異常表達證實與兒童膿毒癥惡化相關(guān)［21］。基于一項單中心、前瞻性隊列研究，OLFM4可能是兒童膿毒癥預后不良的獨立危險因素。OLFM4陽性的中性粒細胞百分比的增加與病死率相關(guān)。OLFM4陽性的升高（≥37.6%）的膿毒癥患者中，56%死亡，而OLFM4陽性的＜37.6%的膿毒癥患者病死率為18%。OLFM4陽性的與病死率之間的關(guān)聯(lián)經(jīng)得起年齡、性別、絕對中性粒細胞計數(shù)、合并癥和疾病嚴重程度的標準測量（SOFA評分，APACHEⅢ）的調(diào)整。OLFM4陽性的中性粒細胞百分比與膿毒癥的60天病死率獨立相關(guān)，并且可能代表了宿主對膿毒癥反應(yīng)異質(zhì)性的新衡量標準。一項以小鼠為動物模型的研究［22］發(fā)現(xiàn)，OLFM4基因缺失的小鼠可以顯著的擺脫膿毒癥影響。當在小鼠中誘導膿毒癥時，OLFM4-null小鼠的存活率顯著增加。膿毒癥誘導后24 h的免疫組織化學表明腎臟中OLFM4的表達增加，其定位于Loop of Henle。與OLFM4-null小鼠相比，野生型小鼠的腎細胞凋亡和血漿肌酐顯著增加。最后，骨髓移植表明腎臟中增加的OLFM4反映了局部產(chǎn)生而不是從血漿中過濾出來。以上研究證實MMP-8和OLFM4與兒童免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

本項目從多角度全面比較了KD患者的差異性基因和特異性免疫細胞表達，并提出2個潛在的臨床標志物。然而，本研究為單中心研究，樣本量有限，尚存在一定的局限性。為了使這些標志物更有效的進行臨床推廣，未來還需要進行多中心、大樣本量研究。

綜上所述，KD患兒主要有MMP-8、OLFM4等288個DEGs。KD患兒外周血中MMP-8、OLFM4蛋白表達水平升高，存在顯著性差異。MMP-8、OLFM4可能作為KD檢測的潛在臨床標志物。