高效液相色譜法測定枸杞中的黃曲霉毒素

李單單，賀金濤

（河南進口肉類指定口岸漯河查驗區服務中心，河南漯河 462000）

黃曲霉毒素（AFT） 是一類化學結構類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉（Aspergillus flavus） 寄生曲霉（A.Parasiticus） 產生的次生代謝產物，在濕熱地區食品和飼料中出現黃曲霉毒素的幾率最高。其具有高毒性和致癌性，1993 年被世界衛生組織癌癥研究機構劃定為I 類致癌物[1-3]。黃曲霉毒素常以AFTB1，AFTB2，AFTG1，AFTG24 種形式存在，其中AFTB1的毒性最強[4]。黃曲霉毒素在農產品中幾乎無法避免，2017 年最新頒布的國家食品安全標準《食品中真菌毒素限量》規定了玉米、玉米面（渣、片）、玉米制品、花生及其制品、花生油、玉米油中AFTB1的最高限量為20 μg/kg，稻谷、糙米、大米、植物油脂（花生油、玉米油除外） 中AFTB1的最高限量為10 μg/kg，小麥、大麥、其他谷物、小麥粉、麥片、其他去殼谷物、發酵豆制品、其他熟制堅果及籽類、醬油、醋、釀造醬中AFTB1的最高限量為5.0 μg/kg。人們經常使用高效液相色譜法檢測試樣中的黃曲霉毒素，能同時對樣品中的黃曲霉毒素種類進行定性、定量分析，具有快速、高效、靈敏、定量準確等優點，在黃曲霉毒素檢測方面發揮著重要的作用，已經成為檢測黃曲霉毒素的主要方法[5-7]。

枸杞兼具多種醫療保健功效，是衛生部批準的藥食兩用食物，能夠增強非特異性免疫功能、提高抗病能力，還具有抗衰老、抗疲勞、抗輻射損傷、調節血脂、降血糖、降血壓、養肝、滋腎、潤肺等多種保健功效。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

安捷倫1200 型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司產品；配熒光檢測器G1321A，Cloversil Myco-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；Aura光化學衍生器PHRED，美國Aura 產品；黃曲霉毒素總量免疫親和柱，北京勤邦生物技術有限公司產品；科樂福12 位泵流操作架；ML204T 型電子分析天平，梅特勒- 托利多儀器上海有限公司產品；多位渦旋振蕩器、超聲波清洗器，中國昆山舒美產品；0.22 μm有機濾膜，天津津騰公司產品。

黃曲霉毒素混合標準物質[Pribolab]；甲醇（色譜純），美國Fisher 提供；試驗用水為Milli-Q Advantage A10 超純水，美國Millipore 公司提供；氯化鈉（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司提供；玻璃纖維濾膜90 mm。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

將黃曲霉毒素混標用體積分數45%的甲醇溶液稀釋成7 個不同質量濃度的標準系列工作液，以此建立標準曲線。其中，AFTB1的系列質量濃度分別為1，4，8， 10，20，40，50 ng/mL；AFTB2的系列質量濃度為0.26，1.04， 2.08，2.60，5.20，10.40，13.00 ng/mL；AFTG1的系列質量濃度為1.2，4.8，9.6，12.0，24.0， 48.0，60.0 ng/mL；AFTG2的系列質量濃度為0.25， 1.00，2.00，2.50，5.00，10.00，12.50 ng/mL。用液相色譜儀對該系列標準溶液進行上機檢測，建立標準工作曲線。

1.2.2 液相色譜條件

液相色譜柱：Cloversil Myco-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；色譜柱柱溫40 ℃；流動相：甲醇∶水= 45∶55，流速0.8 mL/min，進樣量80 μL；熒光檢測器：激發波長360 nm，發射波長440 nm。

1.2.3 樣品前處理

準確稱樣（4.000 g） →加入氯化鈉（1.0 g） →準確加入20 mL 甲醇- 水（70∶30） →振蕩混勻（20 min）→超聲提取（20 min） →離心（8 000 r/min，5 min） →取上清液（10 mL） →加入超純水（30 mL） →渦旋混勻→過玻璃纖維濾紙→準確取20 mL 液體→過免疫親和柱→親和柱中加入10 mL×2 超純水（最后把水抽干） →甲醇洗脫（1.0 mL） →水沖洗（1.0 mL），甲醇和水收集到一起→過有機濾膜→高效液相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 線性關系

在1.2.2 條件下對1.2.1 系列標準品進行測定，以質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的線性回歸方程、相關系數、線性范圍見表1，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2線性范圍見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2 線性范圍

2.2 精密度試驗

在1.2.1 中選擇質量濃度為10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL 的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2混合標準溶液，連續進樣6 次，記錄峰面積。黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2峰面積的RSD 分別為0.79%，1.38%，0.49%，0.54%，表明儀器精確度較好。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL） 的精密度（n=6） 見表2。

2.3 回收率試驗

取陰性樣品，AFTB1的3 個添加水平分別為2.5，10.0，30.0 μg/kg；AFTB2的3 個添加水平分別為0.65，2.60，7.80 μg/kg；AFTG1的3 個添加水平分別為3，12，36 μg/kg；AFTG2的3 個添加水平分別為0.625，2.500，7.500 μg/kg，加入對應體積的標準品靜置過夜，按照1.2.3 樣品前處理方法處理樣品，上機測定。

表2 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（10.0，2.6，12.0，2.5 ng/mL） 的精密度（n=6）

樣品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2回收率（n=3）見表3，高效液相色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.4 檢出限和定量限

根據信噪比S/N=3 和S/N=10 確定目標物的檢出限和定量限，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢出限分別為0.03，0.01，0.03，0.01 μg/kg；黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的定量限分別為0.10，0.03，0.10，0.03 μg/kg。

3 結論

黃曲霉毒素是對人類健康危害較大的真菌毒素，黃曲霉毒素污染問題長期受到社會關注[8]。黃曲霉毒素可能在食品原料中也可能在食品加工、運輸、儲存等任一環節中產生。因此，對黃曲霉毒素的檢測能夠有效保障人們的餐桌安全。

利用免疫親和柱- 高效液相色譜柱后光化學衍生法檢測枸杞中的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，4 種毒素的出峰時間早，節省檢測時間，分離度滿足試驗需求，用柱后衍生的方法操作簡便、實用性強。枸杞既是食材又是中藥，是一種營養成分比較高的植物資源，因此加強對枸杞中黃曲霉毒素的檢測，可為人們放心食用提供數據支持。