秋茄葉片愈傷組織誘導研究

池上評,梁光紅,江傳陽,華偉平

(1.福建省林業(yè)勘察設計院，福建 福州 350003；2.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350005；3.福建省晉江坫頭國有防護林場，福建 泉州 362246；4.武夷學院，福建 武夷山 354300)

1 引言

秋茄(Kandeliacandel) 是我國東南沿海的珍貴木本植物群落——紅樹林(Mangrove)的主要造林樹種[1]，具有重要保護價值。因為紅樹林對調(diào)節(jié)全球的氣候變化具有十分重要的意義[2,3]，又因其具有豐富的生物量而具有巨大的生態(tài)價值[4，5]；同時，完整的紅樹林不僅可以為人類提供良好的游憩場所，又是一個藥源寶庫，因此具有很高的社會價值和經(jīng)濟價值[6，7]。目前秋茄的自然分布北界位于福建北部，緯度為27°20′N ，浙江溫州有少量人工栽培[8～10]。一般采用胚軸(胎生苗)直接插植進行繁殖，不僅繁殖方式單一，還存在繁殖周期較長、效率低、可控性差、人工移植成活率低、成本高及不易大面積推廣等系列問題。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)在林業(yè)上的應用[11]，研究如何利用組織培養(yǎng)這一技術(shù)來解決秋茄擴大繁殖的問題是十分有意義的。目前，對于秋茄的組織培養(yǎng)的相關(guān)報道還很少，2007年黃有軍以秋茄頂芽和幼葉為外植體研究了光照和黑暗條件下，不同激素配比對愈傷組織形成的影響[12]。結(jié)果表明，外源生長素對秋茄的幼葉愈傷組織形成是必需的，1mg/L2, 4-D 或4mg/L以上的NAA 對愈傷組織形成有較好作用。本實驗通過建立紅樹秋茄的愈傷組織體系，一方面可以對其種質(zhì)資源進行離體保存，有利于深入保護和開拓紅樹林植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性；同時為建立再生體系，實現(xiàn)快速繁殖奠定基礎，以最終滿足沿海防護林建設的生產(chǎn)要求。對于發(fā)展與保護紅樹林資源、促進紅樹林生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)都具有重要理論和現(xiàn)實意義。

2 試驗材料與方法

2.1 試驗材料

選自福建省晉江坫頭國有防護林場紅樹植物秋茄的幼葉作為外植體進行組織培養(yǎng)。

2.2 試驗方法

2.2.1 秋茄愈傷組織形成

對新鮮的外植體進行挑選，取其嫩葉，將外植體在洗潔精溶液中浸泡5 min，自來水沖洗2 h，在無菌條件下將外植體置于75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗一次；然后用0.2%升汞溶液消毒8 min，無菌水漂洗4～5次，切取約9 cm2大小的葉塊接種在不同激素配比的培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導。定期觀察葉片愈傷組織的誘導和生長情況。

2.2.2 不同激素配比對秋茄愈傷組織形成的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的外源生長素：2,4-D、細胞分裂素6-BA作激素配比完全試驗，其中，pH值為5.8。置于25 ℃，完全黑暗條件下培養(yǎng)。每處理接種20瓶。培養(yǎng)20 d、30 d、40 d后，觀察記錄愈傷形成情況，并記錄葉片誘導數(shù)，計算誘導率(表1)。

表1 對秋茄愈傷組織誘導的不同激素配比

2.2.3 對秋茄葉片誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基篩選

在通過不同激素配比對愈傷組織形成的影響試驗來初步篩選出合適的激素配比的基礎上，進一步篩選出較高效的激素配比。同樣以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的外源生長素：2,4-D、細胞分裂素6-BA作激素配比完全試驗，并加入瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L， pH值為5.8。置于25 ℃，完全黑暗條件下培養(yǎng)。每處理接種20瓶。培養(yǎng)20 d、30 d、40 d后，觀察記錄愈傷生長狀況，并記錄葉片誘導數(shù)(表2)。

表2 篩選誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基的激素配比

2.2.4 不同消毒時間對秋茄嫩葉消毒效果的影響

不同消毒時間對秋茄嫩葉、莖尖等消毒效果的影響：分別比較0.2%升汞溶液消毒8 min、3 min+5 min、10 min、4 min+6 min對消毒效果(污染率)以及成活率的影響。其中，“+”為消毒時間間隔，時間為2 min。將外植體切成適合大小，接種于MS培養(yǎng)基中。每處理接20瓶，每瓶接4個葉塊。培養(yǎng)20 d后，觀察、記錄。

成活率=成活數(shù)(瓶)/接種數(shù)(瓶)×100%

污染率=污染數(shù)(瓶)/接種數(shù)(瓶)×100%

2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為(25 ± 2) ℃，培養(yǎng)室的相對濕度保持在70%～80%水平，光強為1000～1500 lx，每天光照時間12 h，暗處理則以報紙或牛皮紙覆蓋。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

全文數(shù)據(jù)采用excel軟件進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 愈傷組織形成

接種20d 后在切口處略能看到愈傷組織，呈淡綠色；30d 左右愈傷組織逐漸明顯，松散，呈淡黃色；40d左右愈傷組織呈淡黃色，且不再擴大。約60d 愈傷組織開始變成黃褐色(圖1)。

圖1 愈傷組織的形成

2.2 不同激素配比對愈傷組織形成的影響

由表3可知，不加激素條件下，外植體在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)不能形成愈傷組織，僅施加外源細胞分裂素(BA) 而無外源生長素，同樣不能形成愈傷組織，而在施加外源生長素的前提下，BA在一定的水平下，愈傷組織均可發(fā)生,說明外源生長素對秋茄樹幼葉的愈傷組織形成是必需的。2, 4-D 能誘導愈傷組織的形成，2, 4-D 1 mg/ L 較0. 5 mg/ L 有更好的誘導率，如培養(yǎng)基處理11誘導率比處理7 高，處理10比處理6高，處理12比處理8高。當2, 4-D 濃度提高到2 mg/ L 時誘導率下降。在不添加外源BA 的前提下處理14的愈傷組織能夠發(fā)生，但形成率不高；而添加了外源BA 后，形成率有一定程度提高，其中處理15最高，達10 %。當BA 濃度達4 mg/ L 時，愈傷組織形成率有所下降，說明一定濃度的BA 在愈傷組織形成過程中有增進作用，但濃度不能過高。

表3 不同激素配比對愈傷組織誘導的結(jié)果

3.3 對葉片誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基篩選

由表4可知，在通過不同激素配比對愈傷組織形成的影響試驗來初步篩選出合適的激素配比的基礎上，進一步篩選出較高效的激素配比。其中，處理4激素配比的誘導率最高達到40%，較其它激素配比都較高，且與表1所得結(jié)論相符，得到葉片誘導愈傷組織的最佳激素配比：MS+1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA。

表4 愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基篩選

3.4 不同消毒時間對秋茄幼葉消毒效果的影響

由表5可知，用0.2%升汞溶液對外植體進行連續(xù)的8 min處理的成活率最高，達到65%，污染率最低，為35%；此外，對外植體依次進行3 min+5 min、4 min+6 min、10 min處理的成活率由高變低，依次為55%、50%、45%，污染率由低變高，依次為45%、50%、55%。說明用0.2%升汞溶液對外植體進行消毒時間不能過長，而且在合適的時間內(nèi)連續(xù)消毒會比間隔、多次消毒效果較好。

表5 不同消毒時間對秋茄幼葉消毒效果的影響

4 討論

4.1 秋茄愈傷組織形成條件

本試驗表明：幼葉可以作為紅樹秋茄組織培養(yǎng)的外植體。同時，在挑選外植體材料時，要求所挑選的材料要盡量選取葉片的幼嫩部位，且無機械損傷，防止其在試驗的消毒過程中消毒劑傷害到外植體的細胞，使外植體在誘導愈傷的過程中容易發(fā)生褐變[13]。

4.2 外源物質(zhì)對秋茄愈傷組織的形成的影響

外源生長素對秋茄的幼葉愈傷組織形成是必需的，這與銀杏愈傷組織誘導一致[14]。本試驗通過篩選，得到對葉片進行愈傷組織誘導最佳激素配比為MS+1 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L 6-BA。即當2, 4-D 濃度在1 mg/ L 時有較高的愈傷組織誘導率，添加一定量的外源BA 有助于提高愈傷組織誘導率，但過高的外源BA 則抑制愈傷組織的發(fā)生。據(jù)報道[15～17]，外源物質(zhì)活性炭在組織技術(shù)上具有廣泛的應用，特別是用活性炭來預防外植體褐變的發(fā)生具有重要的作用[18]，值得在今后的深入研究。

4.3 試驗消毒和操作方法的討論

秋茄嫩葉消毒時間連續(xù)進行8min的成活率最高，污染率最低。組織培養(yǎng)對于試驗操作環(huán)境要求很高，在進行組織培養(yǎng)的過程中，要保持操作環(huán)境始終在無菌環(huán)境下；同時，實驗員在試驗操作過程中應該要嚴格遵守實驗室準則和試驗操作流程規(guī)則，保持優(yōu)良的試驗環(huán)境及對試驗操作平臺和儀器進行嚴格的消毒，特別注意操作人員的操作手的消毒；此外，試驗操作人員要注意一些實驗操作技巧，培養(yǎng)自己的試驗操作風格，以降低試驗污染率。