SSR標記對部分茶品種的遺傳多樣性的初步分析

鄭劉芳

茶樹是我國重要的經濟作物之一，我國具有悠久的茶樹種植和利用歷史，我國也是世界上最先發現和利用茶樹的國家。作為一種多年生異花授粉植物，經過長期的自然選擇，茶樹具有豐富多樣的遺傳特性。SSR標記技術具有數量多、共顯性、多態性好、引物通用性高、重復性好、操作程序簡單等優點。目前在多種植物的研究上，SSR標記技術已被廣泛應用。本次利用SSR標記技術和4300 DNA分析系統，更快速，準確地完成了實驗。

一、材料和方法

1.1材料

23個茶樹品種，包括10個安徽黃山茶區的，3個安徽江南丘陵茶區的，5個安徽大別山茶區的，3個福建地區的、1個云南地區的和1個日本數蓓種，取這23個茶樹品種的一芽二葉新梢，將采集的樣品儲藏于-80℃冰箱，備用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取與SSR引物合成 采用改良的CTAB法提取DNA，凝膠電泳法觀察DNA的完整度，根據4300 DNA分析系統的檢測原理，進行PCR擴增，通過4300 DNA分析系統進行成像檢測。

1.2.2 23個茶樹品種的遺傳多樣性分析

（1）基于4300 DNA 分析系統的SSR-PCR擴增

首先以23個茶樹樣品的等量混合液為模板、10μl初始體系對gSSR引物進行PCR擴增， 電泳后有擴增條帶的，再以優化的體系對混合模板進行PCR擴增;再分別擴增所有23個樣品，電泳后統計實驗結果。

根據4300DNA分析系統使用手冊，優化后的PCR擴增體系：1.0 μl DNA（25 ng·μl-1），0.2 μlM13F-F、0.2 μl R 和0.4 μl IR-M13F，0.8 μl dNTPs（25mmol·L-1），1.0 μl 10× Buffer （含Mg2+），0.1 μl Ex-Taq聚合酶（5U·μl-1），6.3 μl無菌水定容至10 μl。所有引物濃度均為1μmol·L-1。

然后均如下程序擴增：95℃預變性3 min;94℃變性45s，50～60℃（因引物而定）退火1.0 min ，72℃ 延伸45s， 10個循環;再進行 94℃變性30 s，51℃ 退火45s，72℃延伸30 s，25個循環;最后72℃延伸10min，4 ℃保存。

（2）變性聚丙烯酰胺凝膠比較與PCR產物電泳檢測

配制acry：bis為29：1，濃度為6.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠。在PCR-SSR擴增產物中加入5 μl 2×DNA Loading buffer，混勻離心，94 ℃變性5 min，然后取0.3 μl在4300 DNA自動分析儀上進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳條件：電壓1 500 V，電流40MA，功率40 W。

1.2.3數據處理與統計分析

根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，采用人工讀帶方法統計條帶。在電泳圖上清晰的條帶記為“1”，沒有條帶或者有模糊條帶的記為“0”，建立原始數據分析，制作Excel表格，生成“0，1”數據矩陣。根據PIC=1-∑Pi2計算SSR 位點的多態性信息量

采用PopGen 1.32計算不同引物的平均期望雜合度He;平均觀測雜合度Ho，以及Nei基因多樣性（H）、Shannon信息指數I。使用NTSYSpc-2.10軟件系統對供試品種進行聚類，構建樹狀聚類圖。

二、結果與分析

2.1 茶樹基因組DNA提取及檢測

采用改良的CTAB法，成功地從供試茶樹鮮葉樣品中提取了基因組DNA。23個茶樹基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示提取的茶樹基因組DNA條帶清晰明亮，沒有降解，沒有彌散， DNA的完整性較好，沒有RNA和蛋白質等雜質的污染，符合SSR-PCR的要求。

2.2gSSR的多態性分析

利用23個茶葉品種，對8個gSSR進行多態性分析，共檢測到32個等位基因，61個基因型 。平均每對引物能夠檢測到4.0個等位基因，最多6個，最少2個;平均每對引物能夠檢測到6.4個基因型，最多11個，最少2個。供試材料的多態性信息量（PIC）變化范圍較大，其中引物的PIC最小為0.1190，PIC最大的為0.7209（引物TGS21），平均值為0.4994。

2.3 供試茶樹品種遺傳多樣性分析

依據材料的來源可以將供試的23份茶樹品種分為六個種群，采用8個gSSR標記進行群體間遺傳多樣性研究。結果表明Nei在0.1271（G228）-0.7543（TGS21）變動，平均值為0.5829。Nei值表示在被檢測位點上群體中雜合子的頻率，是群體雜合程度的度量單位。Nei值越大，反映該群體的遺傳變異越多，群體的遺傳多樣性越高 。

群體的觀測雜合度Ho在0.0455（G227）-0.8696（TGS25）之間，平均值為0.4887。期望雜合度He在0.1300（G228）-0.7731（TGS42）之間，平均值為0.5546。Shannon信息指數（I）為0.2489（G228）-1.4901（TGS42），平均值為1.0295。結果說明供試的茶樹資源擁有較高的遺傳多樣性。

2.4 23個茶樹樣品的聚類分析

使用NTSYSpc-2.10軟件對供試品種進行UPGMA聚類分析，繪制樹狀聚類分析圖。根據32個等位基因相似性矩陣的UPGMA聚類分析表明，在遺傳相似系數為0.65時，可以把23個供試品系（種）分為四個大類，第Ⅰ類與第Ⅱ類分別僅包括云抗10號和豬耳種;第Ⅲ類包括黃山種、楊樹林種、鐵觀音、福鼎大白茶;第Ⅳ類包括余下的17個品系（種）。當以遺傳相似系數為0.67為閾值時，又可將第Ⅳ類劃分為三個亞類，第一亞類包括舒茶早、仙寓早、黃觀音、祁門櫧葉種和安徽1號，第二亞類僅為橫脈種，其余11個品系（種）聚為一類，其中茗洲種與日本數蓓種的遺傳相似系數較高，達到了0.78。聚類結果說明，安徽地區的主要茶樹栽培品種與福建地區的茶樹品種親緣關系較近，與云南地區的茶樹品種親緣關系較遠，符合品種演化規律。

三、結論

（1）茶樹鮮葉基因組DNA的提取在黃建安方法的基礎上，進行了適當的改進，成功的從供試的23份茶樹鮮葉樣品中提取了高質量的基因組DNA。

（2）建立了基于4300 DNA遺傳分析系統的SSR-PCR反應體系，且可以以自行配制的聚丙烯酰胺凝膠溶液替代該系統指定用膠。

（3）對8個gSSR進行多態性分析，共檢測出32個等位位點和61種基因型;SSR具有豐富的位點多態性。

（4）在遺傳相似系數為0.65時，可以把23個供試品系（種）分為四個大類，第一類與第二類分別僅包括云抗10號和豬耳種;第三類包括黃山種、楊樹林種、鐵觀音、福鼎大白茶;第四類包括余下的17個品系（種）。