普魯士藍納米顆粒在生物醫學成像及生物醫學治療中的應用研究進展

代岳 ，蔡璐璐 ，盧佳慧 ，沙萱 ，徐凱 ，李菁菁

1 徐州醫科大學醫學影像學院，江蘇徐州221006；2 徐州醫科大學附屬醫院

普魯士藍（PB）又稱亞鐵氰化鐵，是一種歷史悠久的藍色染料，Fe3+和Fe2+共同存在賦予了PB 特殊的物理、化學、光學和磁性的優勢。早在1936 年，Keggin 和 Miles 就報道了它的結構［1-2］。PB 的特殊分子結構和化學性質，在過去的十幾年引起了研究者們極大的興趣，被廣泛應用于電化學、儲氣、磁學、生物醫學、催化、電池、傳感器等多個領域，其中在生物醫學領域的應用尤為矚目。2003年，PB被美國食品和藥物管理局（FDA）批準作為臨床用藥［3］。隨著納米科學和納米技術的不斷發展，納米材料以其制備簡單可調控、易于表面功能化和功能化組裝、良好的穩定性、較高的載藥率、靶向性等多方面的獨特優勢激發了研究者們的巨大熱情，PB 納米顆粒（PBNPs）同樣具有這些獨特性質。研究［4］表明，PBNPs 具有較好的順磁性和近紅外光聲轉換功能，可作為成像對比劑提高病灶檢出的靈敏度；PBNPs 具有高效的光熱轉換性能，在腫瘤光熱治療（PTT）方面被深入研究［5-6］；此外，PBNPs 具有形貌大小可調節、比表面積大，易于表面功能化的優勢，能夠高效負載化療藥物和成像分子，實現腫瘤藥物協同治療及診療一體化研究［7］；更值得一提的是，PBNPs具有類似于Fe3O4納米顆粒的納米酶特性。有研究［6，8］表明，PB 納米酶能夠清除體內多余的活性氧（ROS），不僅可以用于治療ROS 相關疾病，同時能夠分解腫瘤區域的H2O2，產生O2用于緩解腫瘤區域缺氧的治療耐受難題。現將PBNPs 在生物醫學成像及生物醫學治療中的應用研究進展綜述如下。

1 PBNPs的設計與制備

由于PB的應用范圍廣泛，傳統制備方法多種多樣，包括聚合物保護法、模板合成法、水熱法、沉淀法等［9-10］。PBNPs 的制備策略主要分為雙前體合成法和單前體合成法［3］。雙前體合成法主要通過Fe3+/Fe2+和［Fe（CN）6］4?/［Fe（CN）6］3?直接混合得到PBNPs。CHENG 等［4］直接利用FeCl3和K4［Fe（CN）6］制備得到實心PBNPs，該制備方法簡單，反應時間較短。單前體合成法利用K3［Fe（CN）6］或K4［Fe（CN）6］在酸性條件下通過緩慢的氧化還原反應釋放Fe3+或Fe2+，該制備方法反應時間較長，但制備得到的PBNPs均一性更好。為了使其能夠滿足不同的生物醫學成像、載藥、治療等需求，研究者們對PBNPs 進行了改良制備，從而獲得高載藥率、靶向輸送及診療一體化的多功能納米復合物。中空介孔結構具有較大的表面積和孔容，可作為納米載體負載藥物、基因或成像分子等小分子物質。HU 等［11］研究了一種表面保護、內部刻蝕的方法制備中空介孔普魯士藍（HMPB），該方法利用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作為表面保護劑，鹽酸通過PBNPs 表面的缺陷進入內部，在140 ℃條件下刻蝕PBNPs 形成中空介孔結構。反應時間會影響刻蝕的程度，當反應時間為3.5 h 時PBNPs 內部已經開始形成小的腔隙，當反應時間達到4 h時內部的腔隙有所增大，當反應時間達到4.5 h時，納米顆粒的內部及表面都開始被刻蝕破壞，當反應時間達到5 h 時PBNPs 被完全破壞。因此，可以根據應用的需要控制HMPB內部腔隙的大小。多個研究團隊利用該方法制備了HMPB，利用中空介孔結構負載藥物實現腫瘤的光熱及化療藥的協同治療，負載超聲相變材料構建超聲成像對比劑［12-13］。另有部分學者［4，7，14］引入檸檬酸制備實心 PBNPs，并在其表面修飾聚合物分子、紅細胞膜及靶向分子等，既可逃避免疫系統對PBNPs 的清除，延長體內循環時間，又提高了靶部位的藥物濃度，從而增強治療效果。近幾年，研究者們為了更好地將PBNPs 應用到生物醫學領域，構建了基于PB 的核-殼結構的納米顆粒，例如利用Au 納米粒或Fe3O4作為核心，以FeCl3和K4［Fe（CN）6］作為前體制備PB 納米殼，完美實現了集多種功能于一體的診療納米探針的構建［5，15］。

2 PBNPs在生物醫學成像中的應用

近年來，醫學影像學發展迅速，在疾病診斷和療效評估方面起著不可替代的作用。醫學成像種類繁多，磁共振成像（MRI）、計算機斷層掃描（CT）、超聲（US）成像、熒光成像、光聲成像（PA）、正電子發射斷層顯像（PET）等診斷方式能在無創條件下穿透體表清晰顯示體內結構并幫助診斷疾病，而成像對比劑的引入進一步提高了病灶診斷的靈敏度，從而更清晰的在正常組織結構中辨別病灶，有利于疾病的早期診斷和治療。隨著納米技術的飛速發展，納米對比劑因其高靈敏度、高特異性、較長體內循環時間和功能多樣化等優勢被廣泛研究。PBNPs具有較好的MRI和PA 特性，同時通過其中空介孔結構和表面可修飾的優勢，基于PBNPs結構的熒光成像、US成像、CT 成像也被協同用于疾病的診斷，發揮多模態成像的優勢。

2.1 PBNPs 在 MR 成像中的應用 PBNPs 是由 Fe2+和Fe3+形成的混合價態的六氰合鐵酸鹽，其中和碳原子結合的Fe2+具有較低的自旋（S=0），而和氮原子結合的 Fe3+具有較高的自旋（S=5/2）。2010 年SHOKOUHIMEHR 等［16］研究發現，PBNPs 用于 MRI的縱向弛豫率和橫向弛豫率分別是0.079 m/（M?s）和0.488 m/（M?s），這一發現開啟了PBNPs作為MRI對 比劑 的新篇 章。 2014 年 ，CHENG 等［4］改 進了PBNPs 的制備方法，并在其表面修飾聚乙二醇（PEG），提高其在生理溶液中的穩定性和腫瘤細胞的攝取，通過檢測其作為MRI 對比劑的縱向弛豫率和橫向弛豫率分別提高到6.4 m/（M?s）和8.1 m/（M?s）。由于T1對比劑是陽性對比劑，在臨床診斷中更具優勢，研究者們對于如何提高PBNPs 的縱向弛豫率進行深入研究。CAI 等［17］以 HMPB-Mn 為基礎，搭載化療藥物阿霉素（DOX）構建了pH 響應的HMPB-Mn-DOX 納米探針用于腫瘤的MR 成像和光熱聯合化療。由于腫瘤生長環境偏酸性，研究者在體外進行MRI 縱向弛豫時間的檢測發現，與pH=7.4 時相比，當pH=5 時HMPB-Mn 中的Mn2+被大量釋放出來，T1弛豫時間明顯縮短，HMPB-Mn-DOX 在酸性條件下釋放Mn2+的巧妙設計提高了MRI 診斷腫瘤的靈敏度。PERERA 等［18］結合 PBNPs 和 Gd 構建了一種新型的MRI T1 口服對比劑用于消化道的成像，Gd 的引入使得MRI 的縱向弛豫率和橫向弛豫率分別達到 16.4 m/（M?s）和 20.9 m/（M?s），使 Gd+PBNPs 更適合作為T1 口服對比劑，在家兔胃腸道的體內MRI研究進一步證實了這一觀點。SHOU 等［19］利用10%鋅離子摻雜制備超小SPBZn 納米粒，其MRI 對比劑性能和光熱轉換效率均得到了顯著提高，T1 弛豫率高達18.40 m/（M?s），從而明顯提高卵巢癌腫瘤成像的靈敏度和光熱治療效果。

2.2 PBNPs 在 PA 成像中的應用 PA 成像具有無創無輻射成像的特點，它結合了純光學成像的高對比度特性和純超聲成像的高穿透深度特性，可以提供高分辨率和高對比度的組織成像。2013 年LIANG 等［20］首次證明了 PBNPs 在近紅外區域具有很強的吸收能力，可以作為一種很好的光聲成像的對比劑。SU 等［21］利用介孔二氧化硅包裹 PBNPs 后負載DOX 構建MCF-7 乳腺癌腫瘤診療一體化納米探針PB+mSiO2-PEG/DOX，體內研究表明，當荷瘤小鼠尾靜脈注射納米探針后，光聲信號表現出持續的時間依賴性改變，在注射6 h 后，腫瘤血管的光聲信號明顯增強，能夠清晰的辨別腫瘤邊界。CAI 等［22］報道了將Gd3+集成到PB 納米晶中構建介孔結構HGPB，研究發現在相同濃度下，HGPB在750～970 nm波長處的PA值要高于HMPB，在808 nm時兩者均表現出濃度依賴性PA 信號強度，在相同條件下，不同濃度HGPB 的PA 值均高于HMPB，該結果證實了Gd3+摻雜后的 HGPB 比 HMPB 更能顯著提高 PA 性能，說明HGPB 可以作為一種優秀的PA 對比劑用于腫瘤的診斷。

2.3 PBNPs 在其他間接成像中的應用 鑒于PB?NPs 可以作為過氧化氫酶催化H2O2產生O2，這一功能使PBNPs 在特殊環境中具備超聲成像的性能，2012 年 YANG 等［23］利用 PBNPs 這一作用實現了急性肝炎模型的US/MR 的雙模態成像，并且該US 成像能夠實時監測肝組織內的H2O2水平。此外，基于PBNPs 特殊結構，越來越多的學者嘗試將其他成像分子負載或修飾到PBNPs 上，以期獲得多模態成像效果，提高成像靈敏度和診斷的準確度。JIA 等［12］在HMPB 介孔內包封相變材料全氟戊烷（PFP），HMPB 具有良好的光熱轉換效率，能夠吸收近紅外激光并將其轉化為熱能，所產生的熱量不僅可以通過熱療來殺死腫瘤細胞，還可以促進低沸點的PFP氣化產生氣泡用于US 成像，該研究表明HPB-PFP具有較高的穩定性和光熱轉換效率，HMPB-PFP 有望在US成像引導下的腫瘤治療方面得到廣泛應用。除US 對比劑外，有學者以PBNPs 和金納米粒子（AuNPs）為基礎，開發了用于MR/CT 成像和光熱/放射增敏治療的多功能核-衛星結構的納米粒子CS?NPs［15］；另有學者利用 HMPB 的中空介孔結構和可擴展的表面區域負載吲哚菁綠（ICG）和阿霉素（DOX），構建具有熒光成像、光熱、光動力和化療三種治療方式協同的納米體系［24］。

3 PBNPs在生物醫學治療中的應用

目前，疾病的傳統治療方法大多存在有創性、非靶向性和治療方法單一等缺陷，具備獨特理化特性的納米材料為疾病的無創靶向治療和聯合治療提供了平臺。PBNPs因其在光熱轉換和納米酶方面的優勢和潛力而被廣泛研究，主要包括腫瘤及炎性病變的PTT、抗炎、抗氧化治療等。此外，PBNPs 的中空介孔結構和較大的表面區域能夠高效負載化療藥物，修飾特異性靶向分子，實現藥物的靶向輸送和智能可控釋放，有望顯著提高疾病的治療效果。

3.1 PBNPs 在光熱治療（PTT）中的應用 由于Fe3+和Fe2+之間的電荷轉移，PBNPs 可以有效地將近紅外激光轉化為熱能來提高溫度。FU 等［25］首次研究將PBNPs 作為新一代光熱轉換劑用于腫瘤細胞的治療，研究發現，當808 nm激光照射3 min后，PBNPs溫度即可升高至43 ℃，表明PBNPs 具有良好的光熱轉換效率，與Au納米棒比較時發現在持續照射四個循環后，PBNPs 的光熱穩定性明顯高于Au 納米棒。近年來，越來越多的研究者關注PBNPs 的這一性能。JING 等［26］構建了 PB+Au 診療一體化納米探針，由于其良好的光熱轉換作用，荷瘤裸鼠尾靜脈注入納米探針后，近紅外激光照射6 d后HT-29腫瘤變小消失，持續照射 18 d 后腫瘤無復發。SHOU 等［19］通過摻雜10%鋅離子構建SPBZn 納米探針，能夠提高近紅外光吸收系數和光熱轉換效率，荷瘤小鼠體內實驗表明SPBZn納米探針對乳腺癌模型治療效果顯著，抑瘤率達到69.4%。PBNPs 的光熱轉換作用不僅僅局限于腫瘤的光熱消融治療，還能夠誘導HMPB 負載的超聲相變材料氣化，產生氣泡用于US成像［12-13］。

3.2 PBNPs 在納米酶治療中的應用 納米酶是一種具有內在酶樣特性的納米材料，納米酶以其成本低、易制備、穩定性好、易儲存等優勢有望成為天然酶的替代品。ZHANG 等［8］經系統性的研究發現，PBNPs 具有過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）三種酶活性，能夠有效清除多種活性氧成份（ROS）。細胞實驗中，用順鉑（CDDP）、二烯丙基三硫（DATS）、紫外光照射、再灌注（HR）、氧化低密度脂蛋白（OxLDL）和高糖（HG）誘導細胞發生氧化應激反應，并用不同濃度的PB?NPs 抵抗，發現PBNPs 處理組比PBS 對照組細胞存活率高，并且細胞存活率隨著PBNPs 濃度的升高而升高。由于脂多糖（LPS）能夠誘導肝臟巨噬細胞產生ROS 和炎性介質，通過給小鼠尾靜脈注射LPS 構建急性肝炎模型，而PBNPs 預處理的小鼠尾靜脈注入LPS后，與對照組相比肝臟炎癥反應模型減輕，該研究利用多種方式、從多個角度證明PBNPs 納米酶的ROS 清除性能，為PBNPs 用于炎癥、動脈粥樣硬化、糖尿病等疾病的治療提供新策略。ZHAO 等［27］構建聚乙烯吡咯烷酮（PVP）修飾的PPB 納米顆粒，體外實驗證明其具有較好的清除OH、H2O2和OOH等ROS 的能力，體內實驗通過構建炎癥性腸病小鼠模型來觀察PPBs的療效，靜脈注入小鼠體內后能夠減輕氧化應激反應從而治療炎癥性腸病，研究發現，經靜脈注射PPBs的小鼠幾乎沒有結腸縮短、出血或異常大便的跡象。同時，在組織學分析中，對照組結腸炎小鼠黏膜區域嚴重破壞，免疫細胞大量浸潤，結腸上皮嚴重受損。相反，PPB 處理的實驗組小鼠結腸黏膜區域僅出現輕微損傷，黏膜、肌肉或黏膜下層的免疫細胞浸潤較少，這說明PPBs對炎癥性腸病小鼠有明顯的治療作用。缺血性腦卒中是一種發病率高、預后差的疾病，缺血性損傷后活性氧和氮（RONS）的過量產生是導致腦損傷加重的關鍵因素。ZHANG 等［28］利用 PBNPs 的多功能納米酶作用構建了中空介孔結構HPBZs，不僅能夠減輕氧化應激，還能抑制細胞凋亡和炎癥反應，從而提高腦組織對缺血性損傷的耐受性。動物實驗證明，在缺血/再灌注開始后1 h 給予HPBZs 可顯著提高神經系統評分，促進腦葡萄糖代謝，減少腦梗死體積，因此提出基于HPBZs 的納米平臺具有治療缺血性中風以及其他與RONS 相關疾病的潛力。腫瘤微環境在腫瘤的發生、生長和進展中起著至關重要的作用，ZHANG 等［29］利用低分子量透明質酸修飾 HMPB 構建LMWHA-MPB NPs，發現該納米顆粒可以作為原位巨噬細胞轉化器和O2發生器，體內近紅外成像實驗顯示，IR783 標記的LMWHA-MPB NPs 可以選擇性地在腫瘤部位積累，通過HMPB 的過氧化氫酶作用催化分解內源性H2O2產生O2來緩解腫瘤缺氧情況，并且利用LMWHA-MPB 重塑腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）表型的潛能，抑制4T1腫瘤細胞轉移。

3.3 PBNPs 在藥物負載及輸送中的應用 PBNPs因其獨特的中空介孔結構能夠負載化療藥物，不僅明顯提高載藥率，同時表面修飾靶向分子后可實現藥物的靶向輸送，用相對較小濃度的藥物即可達到相同的治療效果，并且降低傳統藥物的全身不良反應［15，30］。有研究利用腫瘤偏酸性的微環境和HMPB的光熱轉換作用構建智能納米載藥平臺，實現藥物的可控釋放，結果顯示協同治療效果明顯提高［14，31］。一氧化碳（CO）能夠引起線粒體功能障礙，誘導癌細胞凋亡，是一種很有前途的新興治療方法，LI 等［32-33］分別利用HMPB 和Fe（CO）5制備了PB-CO NPs，利用近紅外激光觸發CO 的釋放，加重癌細胞的缺氧環境，促進癌細胞凋亡，研究結果表明，PB-CO NPs 的CO和光熱協同治療對腫瘤的治療效果顯著。

3.4 PBNPs在智能化、多功能化及診療一體化中的應用 隨著人們對PBNPs 研究的深入，一系列獨特性能的發現使其在生物醫學領域的應用日益增多，通過巧妙地設計以及引入靶向分子、成像分子或治療藥物，研究者們構建了多種智能化、多功能化及診療一體化的納米探針，應用在生物醫學診療中。ZHOU 等［13］研究設計了一種腫瘤靶向氧化還原反應的復合生物催化劑，該催化劑可將腫瘤饑餓治療與低溫光熱治療結合，HMPB 介孔內負載葡萄糖氧化酶，表面修飾透明質酸靶向腫瘤細胞，由于HMPB納米酶作用催化H2O2產生O2，同時結合葡萄糖氧化酶的作用增加葡萄糖消耗，并且抑制熱休克蛋白的表達促進低溫光熱療法。YIN 等［34］研究了一種基于HMPB 的近紅外光觸發一氧化碳（CO）釋放系統，該系統可使具有生物還原活性的抗癌藥物替拉帕扎胺（TPZ）選擇性地被缺氧反應激活。Fe（CO）5通過配位作用與HMPB 偶聯，TPZ 被包裹在HMPB 的孔隙中，并以PEG 修飾來延長血液循環，改善腫瘤蓄積。在腫瘤部位近紅外激光照射下，HMPB 的非致死光熱效應釋放CO，加速線粒體耗氧量，加重缺氧，激活TPZ 導致癌細胞凋亡，從而實現協同抗癌作用。ZHANG 等［35］研究了一種基于 HMPB 的智能和多功能納米平臺，其中空介孔結構包封DOX 和全氟乙烷（PFH），體外和體內研究證實，HMPB-DOX/PFH 可作為雙模態成像對比劑，同時增強US 和PA 成像效果，可用于指導和監測腫瘤治療。在高強度聚焦超聲（HIFU）作用下，這種多功能的HMPBs-DOX/PFH能夠以較低的HIFU 強度實現凝固性壞死，同時促進DOX 的釋放，提高了化療療效，該納米平臺實現了雙模態成像引導下的非侵入性協同腫瘤治療。

綜上所述，隨著PBNPs 一系列特殊性能的發現，PBNPs 被認為是一種非常有前途的生物醫學納米材料。前期PBNPs 的MRI、PA 成像及光熱治療、載藥協同治療等主要被用于腫瘤模型，近幾年PB?NPs 納米酶活性的發現更加拓寬了其在醫學領域中的應用，不僅被用于調節腫瘤微環境中氧的水平促進腫瘤治療，同時有望用于多種炎癥性疾病的抗炎、抗氧化治療。然而，所有這些研究仍處于實驗室階段，PBNPs 在體內的藥理作用、毒理作用、藥代動力學特征和生物安全性評價有待進一步深入研究，這將有效促進PBNPs 作為成像對比劑及治療藥物的臨床轉化。