沉默Pard3 基因對宮頸癌細胞系SiHa 遷移、侵襲的影響及其機制

劉迎嘉，阿仙姑·哈斯木

1 新疆醫科大學第五附屬醫院，新疆烏魯木齊830011；2 新疆醫科大學

研究［1］顯示，宮頸癌晚期復發患者預后差，與腫瘤細胞的侵襲和轉移關系密切。分離缺陷基因3（Pard3）的產物是一種分布在正常細胞的極性蛋白，它的改變和缺失都會造成腫瘤細胞的侵襲、轉移［2］。研究［3］發現，JAKs/STAT3 信號轉導通路的激活具有調節免疫系統、促進細胞生長和細胞周期、抗凋亡等作用，并與腫瘤的發生發展密切相關。目前關于Pard3 和JAK2/STAT3 在宮頸癌侵襲轉移中的作用機制尚不清楚。2017 年 6 月 1 日—2020 年 6 月 30日，本研究觀察了沉默Pard3 基因對宮頸癌細胞系SiHa遷移、侵襲的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞分組及Pard3 小干擾RNA 轉染 將人宮頸癌細胞系SiHa 細胞培養于10% 胎牛血清的DMEM 中，37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養，當細胞密度達到80%時用PBS 清洗、0.25%的胰蛋白酶消化后，加入完全培養基，按 1∶3 的比例傳代，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下擴大培養。針對Pard3 轉錄本（GAAGGTCTATGTCTACTGA 和GAAACAGCGTT?GGATGATA）設計小干擾RNA（siRNA）1 和siRNA2序 列 ，分 別 為 GGATAACAGTCGTGTTGAA、GAAGGTCTATGTCTACTGA，并構建Pard3基因沉默腺病毒表達載體。將SiHa 細胞分為siRNA1 組、siR?NA2 組、siRNC 組，siRNA1 組轉染 siRNA1，siRNA2組轉染siRNA2，siRNC 組轉染空白載體，轉染后在37 ℃、5%CO2培養箱中繼續孵育48 h。

1.2 三組細胞遷移和侵襲能力觀察 采用Tran?swell 遷移和侵襲試驗。①Transwell 遷移實驗：取處理好的SiHa 細胞PBS 清洗，0.25%胰酶消化收集，1 000 r/min 離心 5 min，去上清，PBS 潤洗兩次，清洗掉殘余血清，加入無血清DMEM 培養基稀釋細胞濃度至2.5×105/mL，備用。DMEM 培養基中加入Tran?swell 小室，分別接入 200 μL 各組細胞懸液，37 ℃5%CO2培養箱中培養。取出Transwell 小室，PBS 清洗，70%冰乙醇溶液固定細胞1 h，用干凈的棉球將上室一側的未遷移細胞擦干凈，200 倍顯微鏡下觀察拍照，計算細胞遷移相對數量。各組細胞遷移相對數量=各組遷移細胞數/siRNC 組遷移細胞數×100%。②侵襲實驗：取處理好的SiHa 細胞PBS 清洗，0.25%胰酶消化收集，1000 r/min 離心5 min，去上清，PBS 潤洗兩次，清洗掉殘余血清，加入無血清DMEM 培養基稀釋細胞濃度至2.5×105/mL，備用。DMEM 培養基中加入Transwell 小室后，于上室底部中央垂直加入100 μL終濃度為1 mg/mL的Matrigel，待Matrigel 干成膠狀后在Transwell 上室分別接入200 μL 各組細胞懸液，37 ℃ 5%CO2培養箱中培養。取出Transwell小室，PBS清洗，70%冰乙醇溶液固定細胞1 h，用干凈的棉球將上室一側的未侵襲細胞擦干凈，200 倍顯微鏡下觀察拍照，計算細胞侵襲相對數量。各組細胞侵襲相對數量=各組侵襲細胞數/siRNC組侵襲細胞數×100%。

1.3 三組細胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA 檢測 采用實時定量PCR（qRTPCR）法。取各組細胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA，Prime-Script 反轉錄成 cDNA。以 cDNA 為模板，以GAPDH 為內參基因，進行PCR 反應。引物序列如下：Pard3 上游引物為 5′-CAGGTGCATCGCTT?GGAAC-3′，下游引物為 5′-GCTGAGACATTGTTG?GTGCC-3′；JAK2 上 游 引 物 為 5′-GTCATG?GCCCAATTTCGATGG-3′，下游引物為5′-TCGCTC?GACAGCAAAAGTCA-3′；STAT3 上 游 引 物 為 5′-AGAAAACATGGCTGGCAAGG-3′，下游引物為 5′-GCCTCCTTCTTTGCTGCTTT-3′；E-cadherin 上游引物為 5′-CGTAGCAGTGACGAATGTGG-3′，下游引物為 5′-CTGGGCAGTGTAGGATGTGA-3′；Vimentin上游引物為5′-TGAGTACCGGAGACAGGTGCAG-3′，下游引物為5′-TAGCAGCTTCAACGGCAAAGTTC-3′。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個 循 環 。 以 2-ΔΔCt表 示 細 胞 中 目 的mRNA的相對表達量

1.4 三組細胞中Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白檢測 采用 West?ern blotting 法。取各組細胞，用Cell Mitochondria Isolation Kit 試劑盒分離線粒體和細胞漿蛋白，使用DG-3022A 酶標儀測定OD568值，根據標準蛋白濃度和相應的OD 值計算直線回歸方程得出樣品蛋白濃度。將提取的蛋白上清沸水浴變性后和MARKER加入上樣孔進行電泳分離，取出凝膠根據MARKER切下目的條帶轉膜。用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉液浸泡PVDF 膜進行封閉，4 ℃條件下過夜，加入兔單克隆抗體，用PBS-Tween 20洗滌印跡3次，洗滌后HRP 二抗顯影、沖洗膠片，用BandScan 分析膠片灰度值，以灰度值表示目的蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法 采用GraphPad Prism 5 統計軟件。計量資料以-x ± s表示，比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組細胞遷移和侵襲能力比較 ①siRNA1組、siRNA2 組、siRNC 組細胞遷移相對數量分別為122.3±4.3、129.2±7.1、100.0±7.1，其中siRNA1組、siRNA2 組遷移相對數量與 siRNC 組相比，P均＜0.05。②siRNA1 組、siRNA2 組、siRNC 組細胞侵襲相對數量分別為120.5 ± 5.8、131.3 ± 7.9、100.0 ±9.0，其中 siRNA1 組、siRNA2 組侵襲相對數量與siRNC組相比，P均＜0.05。

2.2 三組細胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA 相對表達量比較 siRNA1 組細胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量分別為0.7±0.2、1.2±0.3、1.1±0.1、0.7 ± 0.1、1.9 ± 0.3，siRNA2 組分別為 0.4 ± 0.1、1.0± 0.3、1.1± 0.2、0.5± 0.1、2.4± 0.3，siRNC組分別為 1.0 ± 0.1、1.0 ± 0.2、1.0 ± 0.1、1.0 ± 0.2、1.0 ± 0.1，其中 siRNA1 組、siRNA2 組 Pard3、E-cad?herin、Vimentin mRNA 相對表達量與 siRNC 組相比，P均＜0.05。

2.3 三組細胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對表達量比較siRNA1 組中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vi?mentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對表達量分別為70.8 ± 1.5、101.9 ± 1.4、103.4 ± 7.0、74.6 ± 1.2、152.6 ± 7.4、174.7 ± 11.7、169.0 ± 6.0，siRNA2 組分別為49.6±1.0、102.1±0.9、100.0±6.3、62.6±2.1、182.9 ± 4.4、220.4 ± 5.8、191.7 ± 9.7，siRNC組分別為 100.0 ± 3.6、100.0 ± 3.3、100.0 ± 2.7、100.0 ± 3.1、100.0 ± 1.4、100.0 ± 5.5、100.0 ±3.2，其中 siRNA1 組、siRNA2 組 Pard3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋 白 相 對 表 達 量 與siRNC組相比，P均＜0.05。

3 討論

腫瘤進展的第一步是腫瘤細胞脫離環境獲得運動性和侵襲性，與上皮-間質轉化（EMT）的特征相對應［4］。在EMT 進程中，上皮細胞失去細胞間連接和頂端極性，獲得間質和遷移特性，發生細胞形態和遺傳標記的改變，包括上皮標記（如E-cadherin）的消失和獲得間充質標記（如a-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白）［5-6］。研究［7］顯示，細胞間相互連接作用減弱、失去細胞間黏連并改變細胞極性，往往是導致腫瘤細胞侵襲遷移的關鍵原因，而上皮細胞極性主要是依靠極性蛋白來調控的。

正常上皮細胞沿內部尖端基底軸呈現蛋白質的不對稱分布，呈現極性狀態，這種極性狀態是由極性蛋白介導的。目前已知的極性蛋白有PAR 家族，包括 aPKC、Pard3 和Pard6 構成的極性復合物。研究［8］發現，在食管癌、乳腺癌、肺癌等細胞中，極性和上皮組織的喪失與惡性腫瘤和腫瘤進展密切相關。通過對siRNAPard3 食管鱗狀細胞癌109 細胞系的研究［8］發現，Pard3 過表達降低了109 細胞的基礎增殖率，抑制了DNA 復制，抑制了腫瘤細胞增殖和細胞凋亡，而沉默Pard3 則促進腫瘤細胞增殖和凋亡；與對照組相比，Pard3 過表達顯著降低約50%的細胞侵襲能力，而沉默Pard3則顯著促進109細胞的侵襲能力。乳腺癌細胞株MDA-MB-231 和SK-BR3 中過表達GAB1 增強了與Pard3 的相互作用，導致了Pard3與非典型PKC 極性蛋白復合物的解離，促進了乳腺癌細胞的侵襲、遷移。有報道在人肺腺癌組織中Pard6b 和PKC 的表達低于癌旁正常肺組織，實驗小鼠腺癌組織中Pard3 和PKC 水平亦降低；此外發現Pard3 基因體中的甲基化位點與Pard3 的表達呈正相關，Pard3基因的甲基化增加了細胞對卡鉑的敏感性，對Pard3的抑制增加了肺癌細胞的化療耐藥性。

本研究利用沉默Pard3 基因載體轉染SiHa 細胞，與對照組siRNC相比，實驗組siRNA1、siRNA2轉染48 h 后Pard3mRNA 和蛋白相對表達量呈明顯現下降趨勢，其中siRNA2 組下降更為顯著，說明基于Pard3 轉錄本的兩條小干擾RNA 序列設計成功，同時Pard3基因沉默腺病毒載體轉染SiHa 細胞的基因轉染實驗亦成功。體外siRNA 成功沉默Pard3 基因后，通過對Transwell 小室的基底膜進行侵襲、遷移后附著的細胞數量明顯增加，說明沉默Pard3 后Si?Ha 細胞遷移、侵襲能力增強。ZHANG 等［9］研究發現，抑制miR-483可增加Pard3的表達，抑制miR-483可降低TGF-271 誘導的細胞遷移和侵襲能力，Pard3的下調導致了間變性甲狀腺癌細胞的侵襲，提示Pard3 過表達可減弱腫瘤細胞侵襲、遷移能力，而Pard3低表達或沉默則增強細胞侵襲、遷移。

JAKs/STAT3 是惡性腫瘤增殖、進展和凋亡的經典途徑。LI 等［10］通過建立 3p22.2 抑癌基因與STAT3形成蛋白復合物，阻斷STAT3與JAK2相互作用和 STAT3 磷酸化，IL-6 的刺激增強了 DLEC1 與STAT3 的結合，使STAT3 與JAK2 的相互作用減弱，進而導致STAT3 磷酸化水平降低，最終導致淋巴結轉移、腫瘤復發和轉移。WANG 等［11］體外研究發現，抑制LINC00518 表達可顯著抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。LINC00518的下調抑制了JAK/STAT3 的激活，進而降低了N-cad?herin 和 Vimentin 的表達。研究［12］發現，多種腫瘤中不同抑癌基因可以通過調控JAK/STAT3 通路的活性來抑制腫瘤的發生。有學者［13］首次報道宮頸鱗癌細胞中過表達抑癌蛋白M 受體（OSMR）、抑癌蛋白（OSM）及STAT3持續激活而調控細胞自主前饋信號通路。與抑癌蛋白M 受體過表達相關的惡變前效應主要是由JAK-STAT3 激活介導的，此通路受外源性OSM 和自分泌OSM-OSMR 相互作用所調控。通過中和抗體特異性抑制OSM-OSMR 相互作用，顯著抑制STAT3 激活和前饋信號，導致侵襲、血管生成和遷移減少，提示STAT3被激活、STAT3信號通路被抑制可能是宮頸癌干預治療的有效靶點。本研究發現，與轉染后的siRNC組相比，siRNA1組、siRNA2組的JAK2、STAT3 的mRNA 和蛋白的相對表達量均無顯著差異，而磷酸化的JAK2 和STAT3 蛋白表達增加，siRNA2 組升高顯著，說明沉默Pard3 基因上調JAK2/STAT3 磷酸化信號轉導通路，發揮生物調節功能，促進了腫瘤細胞的侵襲、遷移。

E-cadherin 是一種分布在細胞表面和細胞間連接處的細胞黏附分子，表達缺失可導致細胞連接的破壞，腫瘤組織中E-cadherin 表達缺失提示腫瘤細胞浸潤轉移的可能性較高。Vimentin 主要分布在間葉組織中，因此，E-cadherin 和Vimentin 常被作為腫瘤細胞發生上皮間質轉化即EMT 的遺傳標記。LI等［14］在體外肝細胞性肝癌細胞系中通過靶向E-cad?herin、N-cadherin、Vimentin 和 Twist 相 關 蛋 白 1（Twist），探討了腫瘤抑制因子UPF1 表達水平對EMT 過程的影響，結果顯示，UPF1 過表達時，N-cad?herin、Vimentin 和 Twist 表達水平明顯上調，E-cad?herin 表達下調，蛋白陣列分析則報道了相反的結果。ZHOU 等［15］用免疫組化染色檢測 10 例良性和42 例口腔鱗癌腫瘤組織E-cadherin 和Vimentin 的表達，E-cadherin 在正常口腔黏膜上皮中陽性表達，而波形蛋白在正常口腔黏膜上皮中未見表達；42 人中有26 人（61.9%）和16 人（38.1%）表達E-cadherin 和Vimentin，E-cadherin、Vimentin 表達與淋巴結轉移、腫瘤分期有顯著相關性。本研究發現，siRNA1組和siRNA2組中E-cadherin mRNA 和蛋白相對表達量顯著降低，siRNA2組降低更顯著；siRNA1組和siRNA2組VimentinmRNA 和蛋白相對表達量均顯著升高，其中siRNA2 組顯著升高，提示Pard3 沉默后，SiHa細胞的上皮特征減弱、間質特征增強，導致明顯的上皮間質轉化加速EMT進程。

綜上所述，沉默Pard3 通過上調JAK2/STAT3 信號通路磷酸化，促進SiHa 細胞遷移和侵襲并發生明顯的EMT，從而促進腫瘤進展。