長鏈非編碼RNA AC090809 在人肝癌細胞系中的表達及對Huh7細胞增殖凋亡調控作用觀察

陳雪純，郭夢雅，邵曉雯，黃佳寧，張寧，李詠梅

1 天津醫科大學基礎醫學院遺傳學系，天津300070；2 天津醫科大學基礎醫學院病原生物學系

肝細胞肝癌（HCC）是當今世界上最為常見的惡性腫瘤之一，我國每年有38.3 萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數的50%以上［1］。男性肝癌發病率高于女性肝癌發病率，居腫瘤總發病率的第四位，致死率居于惡性腫瘤死亡率第三位，總生存率僅為36.9%。如何阻止早期HCC 患者術后復發及腫瘤肝內播散，或使無法手術切除的晚期HCC 患者腫瘤控制在局部以實現帶瘤生存，是目前國內外研究的熱點［2］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指長度超過200 個核苷酸的RNA 分子，其上沒有編碼蛋白的閱讀框［3］。雖然lncRNAs 不能編碼蛋白質，但在不同組織和發育階段lncRNAs 的表達具有特異性，說明lncRNAs 具有重要生物學意義。越來越多的研究［4］表明，lncRNAs 通過調節染色質重構、轉錄和轉錄后水平基因表達等機制，在細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等方面發揮著重要作用。我們前期研究中通過分析癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫中HCC 臨床樣本發現，位于8 號染色體上的一條lncRNA AC090809在HCC 組織中低表達，AC090809 高表達的HCC 患者的生存時間要遠長于低表達AC090809 的HCC 患者，表明AC090809 高表達水平可能與患者預后良好相關聯，提示AC090809 可能與HCC 發生發展有關，但AC090809 生物學功能未見報道。2019年10月—2020年12月，本研究觀察了lncRNA AC090809在不同轉移能力的人肝癌細胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3中的表達及對Huh7增殖凋亡的調控作用，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人肝癌細胞系Huh7細胞購自日本研究生物資源收集細胞庫，MHCC97L 和HCCLM3細胞來源于復旦大學湯釗猷院士實驗室。Trans 1-T1感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。DMEM 培養基、胰酶、胎牛血清，Opti-MEM 均購自于美國Gibco公司；轉染試劑Lipofectamine 2000、細胞凋亡FITC-Annexin V and PI Apoptosis、反轉錄ueIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis、實時熒光定量AugeGreenTM qPCR Master Mix等試劑盒均購自蘇州宇恒生物科技有限公司；TRIzol購自美國In?vitrogen 公司；引物合成、shRNA所用表達質粒載體合成自蘇州金唯智生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自以色列Biological Industries公司。

1.2 不同轉移能力的人肝癌細胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 中AC090809 檢測 人肝癌細胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 均使用含10%血清的DMEM 培養基，于37 ℃、5% CO2條件下在恒溫培養箱中進行培養，當細胞密度達到90%～95%時，棄去細胞培養液，用PBS 沖洗2～3 次，加入TRIzol 裂解液1 mL，轉移至1.5 mL去酶去菌的EP管中，室溫靜置2～5 min，加入氯仿后用力渦旋震蕩15 s，待其充分乳化至溶液呈乳白色，室溫靜置2 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，吸取上層水相于新的去酶去菌1.5 mL EP 管中，加入相同體積的異丙醇，將1.5 mL EP 管上下顛倒混勻5 次，室溫靜置10 min，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，棄上清，管底沉淀即為RNA。去提取的RNA 加入75%乙醇洗2次，4 ℃條件下7 500 r/min 離心5 min，吸棄上清，沉淀于超凈工作臺內室溫干燥2～5 min，加入20 μL用DEPC 處理 過的水溶 解RNA，取1 μL RNA 用Nanodrop測量濃度及RNA純度。取1μg模板RNA、4 μL ueIris ⅡRT MasterMix（5×）、1 μL dsDNase 于新的EP 管中，將RNase-free water 加至20μL。將以上體系輕輕混勻，瞬時離心后，在PCR 儀上進行反轉錄：37 ℃孵育2 min，55 ℃孵育10 min，85 ℃孵育10 s。，根據反轉錄得到的cDNA 濃度進行計算，按照說明書的比例將PCR 試劑與cDNA 加入新的EP 管中混勻，上機進行實時熒光定量PCR 檢測。PCR 反應條件為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃，30 s，72 ℃、2min，35 個循環，72 ℃、10min。引物序列如下：AC090809 上 游 引 物 為5′-CGGCATCACG?CATTCGAATTTA-3′，游引物為5′-AGTGCCACAC?CATCAACAGT-3′，內參18s-rRNA 上游引物為5′-GCTTAATTTGACTCAACACGGGA-3′，下游引物為5′-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC-3′。 采 用2－ΔΔCT法計算AC090809 mRNA相對表達量。

1.3 Huh7 細胞的AC090809 降表達shRNA 轉染及轉染后細胞增殖、凋亡情況觀察

1.3.1 Huh7 細 胞 的AC090809 降 表 達shRNA 轉染、分組及驗證 在細胞室超凈臺內用EP管配制以下轉染體系：Opti-MEM 低血清培養基250 μL、目的質粒（AC090809 降表達質粒sh-AC090809 或對照質粒sh-NC）5μL、轉染試劑15μL。輕柔混勻后，室溫靜置20 min。將以上體系緩慢滴加到細胞密度70%～90%的Huh7 細胞中，上下左右搖晃混勻培養液與轉染體系，放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養6 h后，分別補加3 mL DMEM 培養液，待細胞轉染48 h 后，將6 孔板中的細胞進行消化，加入含3 μg/mL 嘌呤霉素的DMEM 培養液重懸，傳代至10 cm 培養皿中。至未轉染的空白對照細胞全部死亡時停止藥物篩選，并使用1.5μg/mL 含嘌呤霉素的DMEM 培養基維持培養。其中，轉染AC090809降表達質粒sh-AC090809 的Huh7 細胞記為降表達組，轉染對照質粒sh-NC 的Huh7 細胞記為對照組，參照“1.2”方法檢測轉染后兩組細胞中AC090809的相對表達量。

1.3.2 轉染后兩組Huh7細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 實驗。分別取100 μL 兩組細胞懸液至96 孔板中，每孔接種1 000 個細胞。將培養板在37 ℃、5% CO2培養箱預培養24 h，向每孔加入100 μL CCK-8 溶液，將培養板在培養箱內孵育24、48、72 h后，用酶標儀測定在450 nm 處各個孔的OD 值，以OD值代表細胞增殖能力。

1.3.3 轉染后兩組Huh7細胞凋亡情況觀察 使用流式細胞儀。取2 組細胞接種于24 孔板中，待細胞密度達到80%左右時，PBS 輕柔沖洗兩遍，加入37 ℃的胰酶消化1 min，加入含10%血清的培養基終止消化，室溫1 000 r/min 離心3 min，冰PBS 緩沖液洗兩遍，加入1×Annexin V 結合緩沖液100 μL 將細胞重懸，然后每管加入FITC -Annexin V、PI 各5 μL，輕輕混合均勻，室溫避光靜置30 min，每管加入200 μL 的1×Annexin V 結合緩沖液，混合均勻上機，用流式細胞儀檢測兩組細胞早期凋亡數、晚期凋亡數。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。計量資料以±s表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用student-t檢驗。P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Huh7、MHCC97L、HCCLM3 細胞中AC090809相對表達量比較 Huh7、MHCC97L、HCCLM3 細胞中AC090809 的相對表達量分別為0.96 ± 0.08、0.08 ± 0.04、0.03 ± 0.01，兩兩比較，P均<0.05，提示不同轉移能力的HCC 細胞中AC090809 相對表達量不同，且AC090809在Huh7細胞中表達量最低。

2.2 轉染后兩組Huh7 細胞中AC090809 相對表達量比較 降表達組Huh7細胞中AC090809相對表達量為0.16±0.03，對照組為1.01±0.07，兩組相比，P<0.05，提示降表達AC090809的Huh7細胞模型成功建立。

2.3 轉染后兩組Huh7細胞增殖能力比較 降表達組培養24、48、72 h 時的OD 值分別為2.31 ± 0.08、4.18 ± 0.09、8.22 ± 0.07，對照組培養24、48、72 h時的OD 值分別為2.10±0.06、2.64±0.08、6.62±0.20，兩組相比，P均<0.05。

2.4 轉染后兩組Huh7細胞凋亡情況比較 降表達組細胞早期凋亡數、晚期凋亡數分別為（222.72 ±11.61）個、（111.63±13.34）個，對照組細胞早期凋亡數、晚期凋亡數分別為（814.35 ± 11.96）個、（324.51±24.82）個，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

HCC 在我國一直以來都是重要健康問題，中國肝癌病例數占全世界總數的55%。肝癌目前主要以手術切除、微創手術、介入手術［6］、局部放療［7］等為主要治療手段。盡管近年來HCC診斷方法和手術技術已得到顯著改善，但是晚期HCC 患者的5年生存率仍然很低，此現象的主要原因是HCC 具有高轉移能力和高復發率［8］。因此，為了提高HCC特別是晚期轉移性HCC的臨床治療效果，深入研究闡明HCC細胞惡性生物學行為的分子機制具有非常重要意義。

lncRNAs 是一類不具有編碼蛋白能力的長鏈非編碼RNA，起初被人們認為是轉錄的噪聲［9］。隨著科學發展，人們逐漸發現lncRNAs 即便不能編碼蛋白，但是它可以通過與蛋白、mRNA 之間的相互作用，影響轉錄、翻譯等生物學行為［10］。并且lncRNAs也存在于人類各種腫瘤中，在腫瘤中可以作為分子支架、分子誘餌、分子向導去發揮功能，在一定程度上影響腫瘤的增殖或遷移［11-16］。目前研究較為明確的lncRNAs 尚不多［17］，仍有大量lncRNAs 值得我們繼續深入研究。

本研究中的lncRNA AC090809 是一條位于8 號染色體、長度為61 602 bp 且不具備蛋白編碼能力的非編碼RNA。本實驗室前期分析了TCGA 公共數據庫中HCC 患者AC090809 表達量情況與患者生存狀況與生存時間，結果顯示AC090809 基因高表達的肝癌患者的生存時間比AC090809 基因低表達的HCC 患者生存時間長，表明高表達AC090809 與患者的良好預后相關聯。TCGA 數據庫的分析結果提示我們，lncRNA AC090809 的表達可能與HCC 的發生發展有關。MHCC97L 與HCCLM3 是兩株具有相同遺傳背景、高轉移潛能的人肝癌細胞株，且HC?CLM3 的轉移潛能更高，肺轉移率為100%［18］。Huh7是一株來源于52 歲日本男性高分化肝癌細胞株［19］，其轉移能力遠低于MHCC97L 與HCCLM3 細胞［20］。因此為了驗證我們的猜想，在轉移能力依次增強的人 肝 癌 細 胞 系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 中 對AC090809 的表達量進行實時熒光定量PCR 實驗檢測，實驗結果顯示低轉移潛能人肝癌細胞株Huh7細胞中AC090809 的表達水平明顯高于高轉移潛能人肝癌細胞株MHCC97L 與HCCLM3 細胞，這提示AC090809 可能與HCC 細胞的轉移能力相關。因AC090808 在Huh7 細胞中表達量最高，所以我們選擇在Huh7 細胞中降表達AC090809 檢測AC090809對HCC 增殖能力的影響。接下來我們利用shRNA轉染Huh7 細胞，經抗生素篩選獲得穩定降表達AC090809 的Huh7 細胞。我們利用穩轉的Huh7 細胞進行了CCK-8 實驗，CCK-8 結果顯示降表達AC090809 對細胞的增殖具有明顯的促進作用。最后我們用流式細胞儀檢測了FITC-Annexin 與PI 染色的細胞。Annexin V 選擇性結合磷酯酰絲氨酸（PS），細胞發生早期凋亡時，PS 會外翻到細胞表面，用綠色熒光探針FITC 標記的Annexin V 可以結合外翻的PS。PI是一種DNA結合染料，常用來染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性細胞中的細胞核。PI經488、532或546 nm的激光激發后呈現紅色熒光。流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組細胞相比，降表達組細胞的早期凋亡與晚期凋亡細胞數目明顯減少。因此，通過CCK-8 實驗和凋亡實驗的檢測我們發現，降表達AC090809 可以明顯促進HCC細胞的增殖、抑制細胞凋亡，以上結果說明AC090809對HCC細胞增殖具有一定抑制作用。

綜上所述，AC090809 在轉移能力最低的Huh7細胞中表達量最高，并且在HCC 細胞中降表達AC090809會促進細胞增殖、抑制細胞凋亡。本研究展示了一個與HCC 細胞增殖相關的新的lncRNA，為HCC患者的早期診斷與治療提供了新的靶點。