西方許旺酵母及其工業應用概述

孟 秋，章亭洲

（浙江科峰生物技術有限公司，浙江 海寧 314400）

1909年，Kloecker在西印度群島的圣托馬斯島首次分離到一類子囊孢子酵母，并將其命名為西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）。隨后Schw castellii、Schw alluvius和Schw persoonii也逐漸被分離出來，雖然他們的發酵特性和西方許旺酵母有較明顯的區別，但C. W. Price 等基于DNA 重組試驗分析將以上四種菌統一命名為Schw occiden?talis。 其 中Schwo ccidentalis、Schw castellii和Schwalluvius的序列同源性超過97%，稱為西方許旺酵母西方變種（Schw occidentalis var. occidenta?lis）；而Schwpersoonii與Schwoccidentalis的序列同源性僅有80%左右，稱為西方許旺酵母皮爾松變種（Schw occidentalis var.persoonii）[1]。

許旺酵母屬（Schw anniomyces）是酵母科內孢子目的一個成員，它同被廣泛研究的酵母屬、克魯維酵母屬和漢森酵母屬一樣，均屬于酵母亞科[2]。西方許旺酵母最引人注意的特征之一在于它可以分泌α-淀粉酶和糖化酶，對淀粉進行高效降解，這也是西方許旺酵母在工業生產中的重要應用之一。

1 西方許旺酵母生理生化特征

1.1 形態特征

在YM 固體培養基中25 ℃培養3 d 后，西方許旺酵母細胞呈圓形及卵圓形，細胞大小為3～8 μm×3～10 μm；菌落為圓形、凸起、乳白色；可形成假菌絲，產生1個長彎曲形子囊孢子，這也是它有別于其他子囊菌孢子的一個重要特征[2]。

1.2 代謝特征

西方許旺酵母能夠利用多種有機化合物作為碳源，如葡萄糖、果糖、半乳糖、D-木糖（后兩者不能被皮爾松變種同化吸收）、蔗糖、棉籽糖、纖維二糖、海藻糖、乳糖（某些菌株）、琥珀酸酯、檸檬酸酯、乙醇、正構烷烴（皮爾松變種除外）、麥芽糖、異麥芽糖、糊精以及可溶或者原淀粉等。需要注意的一點是，蜜二糖并不能被該屬細菌利用，也不能在不含維生素的培養基上生長，且無硝酸鹽呼吸能力[3-4]。植酸酶能夠將肌醇六磷酸酯轉化成無機磷酸鹽和肌醇單-五磷酸鹽，目前認為，西方許旺酵母中植酸酶活性在所有酵母菌中是最高的，且該屬菌株能夠以肌醇六磷酸酯為唯一磷酸來源進行生長[5]。

西方許旺酵母的呼吸作用不受高糖濃度的抑制，并且在有氧條件下幾乎不會進行發酵[6-7]。這也說明它沒有明顯的葡萄糖效應，并表現出較強烈的巴斯德效應。C.Poinsot等[8]分離出一株細胞色素b合成缺陷的許旺酵母，與出發菌株不同的是，該菌株表現出明顯的葡萄糖效應，且巴斯德效應降低，表現為在相同的有氧條件下發酵速度顯著增強。表明西方許旺酵母呼吸替補通路的存在。

1.3 生命周期

西方許旺酵母細胞呈卵形（3.5～8.0 μm×4.5～9.0 μm），無性繁殖方式為出芽繁殖，假菌絲體呈不規則形態[9]。細胞一般以單倍體形式存在。許旺酵母屬細胞間不能發生基因融合重組，但母細胞和子細胞在形成子囊孢子前可發生融合。電子顯微鏡觀察發現，母細胞與子細胞融合后，首先被細胞壁分隔開，進而進行核融合，并進一步在母細胞中發生減數分裂。融合后的母細胞會在融合部位的細胞壁上出現一個黑色的環，有時也可以通過細胞壁接觸區域的殘留來加以區分。許旺酵母通過形成一個或兩個核桃狀的子囊孢子進行有性繁殖，它們一般為寬而平的長突起。也有研究表示，皮爾松變種形成的赤道環和突起可能與其他許旺酵母有所區別[10]。從許旺酵母整個生命周期來看，二倍體的出現是核融合的結果，此時的細胞更利于在不良條件下生存[11]。

2 西方許旺酵母培養基的選擇

西方許旺酵母與釀酒酵母的完全培養基（YPD培養基）和基本培養基（SD 培養基，以葡萄糖為碳源）相同。其中YPD 培養基組分為1%的酵母膏、2%蛋白胨和2%的葡萄糖。西方許旺酵母的最小基本培養基需含有酵母基礎氮源以及所需氨基酸和碳源，可將其溶解于0.2 mol·L-1Na2PO4（pH 值為6.3）的緩沖液中，以維持淀粉酶的活性。

不同培養基對酵母孢子形成的誘導效率不同。用酵母提取物或葡萄糖瓊脂培養基室溫培養5 d后，可誘導西方許旺酵母孢子形成。A. P. James等[12]配制含有1.3%的酵母提取物、0.5%的蛋白胨和1.5%的葡萄糖培養基，pH 值調整為4.5，9 ℃下培養20 d后觀察到酵母孢子形成。酵母麥芽提取物瓊脂培養基上也可產芽孢[11]。

3 西方許旺酵母的原生質體融合

J.J.Wilson 等[13]通過聚乙二醇誘導營養缺陷型突變體的原生質體融合，從而產生重組菌株。有些重組子是不穩定的異核體，有些重組子是穩定的二倍體（或非整倍體），它們可以和新的營養缺陷型菌株發生有絲分裂。通過添加對氟苯丙氨酸可以增加有絲分裂頻率。減數分裂不會改變雜交種的倍性，因此原生質體融合是構建許旺酵母多倍體菌株的有效方法，并可用于互補試驗中突變體的特性描述，甚至用于減數分裂的遺傳特征分析。然而，原生質體融合似乎并不能產生具有新標記的單倍體重組子[13-14]。

西方許旺酵母細胞的原生質體可以在溶胞酶、解旋酶、蝸牛酶、β-葡萄糖醛酸酶或非水溶性葡聚糖酶的作用下產生[12-16]。

西方許旺酵母的轉化方法和其他酵母菌（如釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母和漢遜酵母）相同[17]。此外，許旺酵母還可進行電轉化以及醋酸鋰介導的酵母細胞高效轉化[18-19]。

4 西方許旺酵母的淀粉分解系統

α-淀粉酶可水解淀粉分子的α-1，4 糖苷鍵。研究表明，西方許旺酵母分泌的α-淀粉酶同時具有α-1，6 糖苷鍵水解活力，可在與糖化酶的協同作用下快速降解淀粉[14，20-21]。

通過構建許旺酵母α-淀粉酶基因缺失突變株（ΔGAM1），發現其仍然能夠在含有淀粉或以支鏈淀粉作為唯一碳源的培養基上生長，盡管生長狀況和淀粉水解能力顯著降低。這一現象產生的原因是許旺酵母胞內存在其他活性較低的淀粉水解酶。盡管如此，GAM1顯然是發揮淀粉酶活性的主要功能酶[22]。

α-淀粉酶基因的表達受到嚴格的調控。西方許旺酵母中α-淀粉酶編碼基因AMYl、SWA2 以及GAMl 基因都會受到葡萄糖抑制[23-24]。在葡萄糖匱乏時，α-淀粉酶和糖化酶的表達受麥芽糖、可溶性淀粉和棉籽糖等的誘導，且對溫度高度敏感（37 ℃時被抑制）[25-26]。當pH值低于3.5或溫度高于55 ℃時，西方許旺酵母中的α-淀粉酶和糖化酶均會失活，60 ℃以上時該酶被不可逆抑制。

由于在厭氧條件下糖化酶和α-淀粉酶的表達受到抑制，許旺酵母不能在麥芽糖和淀粉培養基中進行代謝，因此表現出明顯的克拉布特里效應[27-30]。雖然西方許旺酵母可表達麥芽糖滲透酶和α-葡萄糖苷酶，但在待測菌株中淀粉酶活性似乎是影響麥芽糖利用率的限速酶。葡萄糖是淀粉酶的產物之一，同時也是其表達的抑制物。這一反饋調節作用也解釋了生長穩定期該酶表達活性較高的原因[25,31]。靜止期時，底物水解產生的葡萄糖不足以達到抑制濃度，葡萄糖淀粉酶的表達可以不受抑制地進行；在含有2%可溶性淀粉的培養基中，通過增加淀粉酶編碼基因GAM1的拷貝，使培養基中葡萄糖濃度迅速增加，這將對GAM1造成反饋抑制，直到葡萄糖濃度降到足夠低的水平，從而進行新一輪的誘導表達。

5 西方許旺酵母的工業用途

5.1 在工業乙醇生產中的應用

在工業乙醇的生產中，玉米等淀粉原料經研磨、“糊化”和“液化”作用，繼而在α-淀粉酶和糖化酶的作用下進行“糖化”。“糖化”產生的糖類物質進一步通過釀酒酵母發酵產生乙醇。在釀造啤酒或生產麥芽威士忌等的過程中，由于一些不可發酵的麥芽糊精的存在，使得淀粉的糖化效率低。為了降低產品中糊精的含量，通常引入西方許旺酵母來提高糖化效率。一方面，可以通過外源添加西方許旺酵母來源的高效降解酶[32]；另一方面，將西方許旺酵母來源的淀粉高效降解基因在釀酒酵母中進行異源表達。在釀酒酵母中異源表達西方許旺酵母的α-淀粉酶和糖化酶，已經基本實現了淀粉的完全水解[33-34]。

5.2 在煙草增香提質方面的應用

煙草中的類胡蘿卜素是煙草香氣成分的重要前體物質。類胡蘿卜素在進行氧化降解時，由于雙鍵斷裂的位置不同可形成不同的產物，并進一步產生不同的香味物質。西方許旺酵母可以降解類胡蘿卜素，生成β-紫羅蘭酮、β-環檸檬醛、2,2,6-三甲基環己酮和二氫獼猴桃內酯等香味物質[35]。

國內外學者對煙草發酵過程中的微生物進行了分離鑒定，發現煙葉表面分離得到的西方許旺酵母接種量影響煙葉復烤后香氣組成[36]。鄭堅強等[37]通過分析西方許旺酵母雙加氧酶的添加量、發酵溫度和發酵時間對煙草增香效果的影響，確定了實驗室條件下利用西方許旺酵母進行煙葉增香的最佳條件。

5.3 在油脂生產方面的應用

伴隨著生物技術的發展，人們對微生物產油的研究越來越多。產油微生物能夠以脂質形式積累油脂達其自身總生物量的20%（w/w）以上，是工業化油脂生產的重要載體[38]。西方許旺酵母是產油酵母的一種，能夠利用廣譜糖類（C5 和C6）進行產油發酵，并能夠產生高達其總生物量42%的脂肪酸[39]。為了得到酵母胞內生產的油脂，可以采用化學或物理的方法破壞細胞壁，然而這些方法往往造成油脂提取效率低以及副產物易受到破壞。目前R.Heshof等[40]發明了一種有效的溫和酶解方法來破壞細胞，以促進從西方許旺酵母中提取脂質。

含脂質的多不飽和脂肪酸具有良好的營養價值，有利于健康，并與減少動脈粥樣硬化、炎癥和致癌作用相關聯。人類和其他高等動物無法合成某些多不飽和脂肪酸，例如亞油酸，它們依賴于日常中攝取的飲食（如豆油和亞麻籽油）來獲取。D.Lamers 等[41]通過過表達Δ12-去飽和酶，大大提高了西方許旺酵母中多不飽和脂肪酸含量，尤其是亞油酸的產量.

6 總 結

西方許旺酵母具有不同于釀酒酵母等的生理生化特點和優勢。其中，西方許旺酵母分泌的α-淀粉酶不僅具有α-1,4 糖苷鍵水解活力，還可部分代替糖化酶的功能，使淀粉得到高效水解。淀粉的原材料來源廣泛且價格低廉，在工業生產中可替代價格較為昂貴的糖蜜。西方許旺酵母高效水解淀粉的能力也使其用作飼料酵母單細胞蛋白，作為優質蛋白源部分或全部替代魚粉和肉骨粉等。此外，西方許旺酵母在煙草增香和油脂生產方面也具有巨大潛力。伴隨著微生物在工業生產方面的研究發展，西方許旺酵母必將具有更加廣闊的應用空間。