豬細(xì)小病毒病滅活疫苗純化濃縮技術(shù)研究

李應(yīng)鶴，初曉紅，宋 揚(yáng)，徐 剛，李 贄，于 鐳

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

豬細(xì)小病毒病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的三種重要傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，為了預(yù)防和控制這類疾病，應(yīng)用安全、高效的疫苗是最主要的解決途徑。為了探索濃縮純化后的病毒液的免疫效果，本試驗(yàn)擬采用中空纖維柱濃縮純化技術(shù)對(duì)豬細(xì)小病毒L株滅活病毒液進(jìn)行過濾純化，并制備成滅活疫苗進(jìn)行安全與效力檢驗(yàn)[1-2]。

1 材 料

1.1 制苗用病毒液

豬細(xì)小病毒L株滅活病毒液（滅活前病毒液紅細(xì)胞凝集價(jià)為1∶512，病毒含量為107.36TCID50·mL-1），由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備和提供。

1.2 主要試劑

MontanideTMISA 206 VG佐劑，購自法國賽比克公司；2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA），購自Sigma 公司；0.02 mol·L-1PBS、氯仿等原料，購自國藥集團(tuán)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.3 紅細(xì)胞凝集抑制抗原

豬細(xì)小病毒L株，批號(hào)為PPV-HI Ag-201401，紅細(xì)胞凝集價(jià)為1∶512，規(guī)格為1.0 mL·瓶-1，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備和提供。

1.4 中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)

中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)，華泰凈化技術(shù)工程有限公司提供。

1.5 紅細(xì)胞懸液

0.5%豚鼠紅細(xì)胞懸液，按現(xiàn)行《中國獸藥典》制備。

1.6 試驗(yàn)動(dòng)物

2～4日齡豚鼠，體重350～400 g，豬細(xì)小病毒HI抗體效價(jià)低于1∶8，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；1.5～2 月齡的仔豬（豬瘟中和抗體陰性、豬細(xì)小病毒HI 抗體不超過1∶8），購自黑龍江省哈爾濱市郊某豬場，品種為長白。

2 方 法

2.1 病毒液純化與濃縮

2.1.1 病毒液澄清

按程序安裝澄清用的0.45 μm的中空纖維柱及管路，用25%乙醇清洗中空纖維柱內(nèi)的保存甘油，再用純化水沖洗，然后以2%NaOH 循環(huán)清洗中空纖維柱并浸泡過夜，再用純化水清洗中空纖維柱內(nèi)殘留堿液至中性并測定水通量，用PBS平衡中空纖維柱。無菌連接中空纖維柱的進(jìn)液、回液與透過液，將病毒液進(jìn)行澄清處理。

2.1.2 中空纖維濃縮純化

安裝規(guī)格為100 ku 中空纖維柱及管路，再用2%NaOH 循環(huán)清洗中空纖維柱并浸泡過夜，然后用純化水沖洗中空纖維柱內(nèi)殘留堿液至中性并測水通量。用無菌PBS平衡中空纖維柱。無菌連接中空纖維柱的進(jìn)液和回液后進(jìn)行濃縮處理，處理時(shí)保持泵轉(zhuǎn)數(shù)在15%～20%。每批樣品分別濃縮20倍，用PBS連續(xù)洗濾濃縮液2～3次，以洗濾出液體計(jì)算洗濾次數(shù)。

2.1.3 病毒液重懸

按豬細(xì)小病毒原液量1/2 體積（即相當(dāng)于最終進(jìn)行2倍濃縮）加入PBS溶液，重懸后即得2倍濃縮的病毒液。

2.2 疫苗配制

分別用豬細(xì)小病毒滅活原液和2倍濃縮液分別配制3 批疫苗。原液配制的3 批疫苗批號(hào)分別為YY-201401、YY-201402 和 YY-201403，2 倍濃縮液配制的3 批疫苗批號(hào)分別為NS-201401、NS-201402和NS-201403。

2.3 檢測

2.3.1 紅細(xì)胞凝集價(jià)的測定

分別對(duì)豬細(xì)小病毒原液、2倍濃縮液以及中空纖維濃縮濾過液進(jìn)行紅細(xì)胞凝集價(jià)的測定。

2.3.2 安全檢驗(yàn)

用乳鼠檢驗(yàn)：用2～4 日齡乳鼠30 只，隨機(jī)分為6 組，每組5 只，各經(jīng)皮下注射疫苗0.1 mL，設(shè)條件相同的對(duì)照乳鼠5只，相同環(huán)境下飼養(yǎng)，觀察7 d[3]。

用豬檢驗(yàn)：用斷奶后1.5～2月齡豬12頭（豬瘟中和抗體陰性、豬細(xì)小病毒HI 抗體不超過1∶8），隨機(jī)分為6組，每組2頭，各經(jīng)深部肌肉注射疫苗5 mL，設(shè)條件相同的對(duì)照豬2 頭，相同環(huán)境下飼養(yǎng)，觀察21 d。

2.3.3 效力檢驗(yàn)

用體重350～400 g 豬細(xì)小病毒HI 抗體效價(jià)低于1∶8的豚鼠30只，隨機(jī)分為6組，每組5只，分別肌肉注射疫苗0.5 mL。28 d后連同條件相同的未注射對(duì)照豚鼠2只，采血，測定HI抗體效價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅細(xì)胞凝集價(jià)測定結(jié)果

從濃縮前后紅細(xì)胞凝集價(jià)測定結(jié)果看，豬細(xì)小病毒原液與2倍濃縮液紅細(xì)胞凝集價(jià)無差異。

3.2 安全檢驗(yàn)結(jié)果

從疫苗的安全檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，豬細(xì)小病毒原液配制的疫苗和2倍濃縮液配制的疫苗在安全檢驗(yàn)上都是安全的，但從本動(dòng)物安全檢驗(yàn)體溫檢測指標(biāo)上比較，原液配制的疫苗一過性體溫總體要高于2倍濃縮液配制的疫苗。

3.3 效力檢驗(yàn)結(jié)果

從疫苗的效力檢驗(yàn)結(jié)果上看，兩種疫苗免疫豚鼠，各組免疫豚鼠有5/5出現(xiàn)抗體反應(yīng)，其HI抗體效價(jià)均不低于1∶64。

4 結(jié) 論

驗(yàn)證的純化濃縮工藝采用0.45 μm的中空纖維柱去除細(xì)胞碎片，采用規(guī)格為100 ku空纖維柱對(duì)豬細(xì)小病毒原液做20 倍濃縮，然后按不低于原液量1/2 體積的PBS 液重懸后作為濃縮抗原。用豬細(xì)小病毒原液和2倍濃縮液分別配制疫苗，對(duì)兩種疫苗的安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，上述兩種疫苗安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定，但2倍濃縮液配制的疫苗安全性明顯優(yōu)于原液制備的疫苗，證明該純化濃縮工藝是有效可行的。