水楊酸和脫落酸浸種對低溫下扁蓿豆種子萌發和幼苗生長的影響

李 穎，魚小軍，趙一珊，王 琳，彭 珍，范麗花，王玉霞，馬曉東

(甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅省草業實驗室，甘肅 蘭州 730070)

扁蓿豆(Medicagoruthenica)一種多年生軸根性中旱生豆科(Leguminosae)牧草，生態適應性廣、抗旱抗寒、耐瘠薄、營養價值較高，對改良天然草場、建立人工草地、提高草原生態系統中的氮素水平有重要意義[1]。扁蓿豆通常栽植于高寒草甸、高寒草原等地區[2]，其在早春栽植過程中常遭遇持續低溫危害，導致出苗不齊、出苗期推遲等不良現象，這不僅影響幼苗的生長，更對群體的建成極其不利[3]。種子萌發和幼苗生長是植物生長周期中生理代謝最旺盛、最敏感的階段[4]，低溫可能會損害其生長，甚至不能完成生命周期，使植物的形成變得不可行。為此，尋求扁蓿豆抗寒的途徑和方法對提高扁蓿豆在低溫條件下的快速萌發和幼苗生長具有重要意義。

近幾年來，對外源物質緩解環境脅迫下種子萌發的研究引起了眾多學者的研究興趣，國內外報道很多[5-8]，選用的外源物質有水楊酸(salicylic acid,SA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)、2，4-表油菜素內酯(2，4-epibrassinolide，EBR)和赤霉素(gibberellin acid,GAs)等。水楊酸(SA)在調控植物抗寒冷性上有重要作用，當植物抵御寒冷環境時，它可激活植物超敏反應(Hypersensitive response,HR)和系統獲得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR)[9]，從而影響植物種子萌發。研究證實[10-13]，一定濃度的SA可促進棉花(Gossypiumspp)、黃秋葵(Abelmoschusesculentus)、辣椒(Capsicumannuum)、玉米(Zeamays)等種子發芽且增加根長和芽長，其中，提高不同植物種子抗寒冷性的最佳濃度不同。脫落酸(ABA)在植物干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫反應中起重要作用,是植物的抗逆誘導因子,也被稱為植物的“脅迫激素”[14]。崔華威[15]的研究表明，1 g·L-1ABA浸種處理可提高低溫下煙草(Nicotianatabacum)種子發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數，楊曉娟等[16]在不同ABA濃度對冬油菜(Brassicacampestris)處理中表明低濃度ABA浸種促進種子萌發和幼苗生長，而高濃度有抑制作用。

目前，外源物質添加對扁蓿豆種子萌發的研究多集中于干旱脅迫條件下，研究結果表明，適度的一氧化氮、水楊酸(SA)預處理對其種子萌發和分枝期的生長有促進作用[17-18]。然而，在低溫脅迫下，SA和ABA浸種對扁蓿豆種子萌發和幼苗生長的影響尚未見報道。因此，本研究以扁蓿豆為試驗材料，通過不同濃度的SA和ABA浸種來探索其在低溫條件下對種子萌發和幼苗生長的影響，從而篩選出低溫下提高扁蓿豆種子發芽能力的SA和ABA的最佳濃度，旨在為高寒地區扁蓿豆的早春栽植和外源激素在農業生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試扁蓿豆種子于2018年9月采收于甘肅省武威市黃羊鎮甘肅農業大學牧草試驗站，試驗站地理位置為103°15′ E，37°30′ N，海拔1 660 m，屬于內陸性氣候，干旱少雨，日照充足，蒸發量大；年均氣溫8℃，最高溫39.5℃，最低溫—26.5℃。年均降水量154.6 mm，多集中在7，8，9月。土壤為粉砂壤棕鈣土，有機質含量為10.38～10.60 g·kg-1,全氮含量為5.37～7.07 g·kg-1、全磷含量為3.03～3.32 g·kg-1、速效鉀含量為69.94～119.95 mg·kg-1；pH值為8.67～8.70[19]。

1.2 試驗設計

試驗前先采用98%的濃硫酸浸泡扁蓿豆種子15 min，然后流水沖洗3次[20],再以不同濃度的SA和ABA溶液于室溫下分別浸種12 h，對照(CK)采用蒸餾水浸種12 h。SA處理濃度分別為0.1，0.5，1，5，10，20，50和100 μmol·L-1，分別記為S1～S8；ABA處理濃度分別為0.001，0.01，0.05，0.1，0.5，1，2和5 μmol·L-1，分別記為A1～A8，SA和ABA分別設有8個濃度梯度，共17個處理，每處理重復3次。試驗于2019年在草業生態系統教育部重點實驗室進行。種子萌發采用培養皿濾紙法，待浸種完成后挑選籽粒大小一致飽滿的扁蓿豆種子，置于鋪有2層濾紙的培養皿內，每個培養皿50粒。置于人工氣候培養箱中，培養條件為光照12 h·d-1，黑暗12 h·d-1，模擬天祝高寒區5月初的情況，溫度設置為5℃ 12 h，15℃ 3 h，20℃ 2 h，25℃ 2 h，20℃ 2 h，15℃ 3 h這 6個區段循環交替進行。發芽期間每日定時補充水分以保持濾紙濕潤。

1.3 測定指標及方法

以置入培養皿的第2 d為種子開始萌發的第1 d，逐日定時記錄發芽情況(以胚根伸出并達到種子長度的1/2為標準)，在3 d時測定發芽勢，7 d測定發芽率、發芽指數、活力指數，發芽結束后每個培養皿隨機選取10株幼苗測定根長和芽長[21]。

發芽勢(GE)=(發芽試驗初期規定日期內發芽種子數/供試種子數)×100%；

發芽率(GP)=(發芽試驗末期規定日期內發芽種子數/供試種子數)×100%；

發芽指數GI=∑Gt/Dt；

活力指數VI=GI×S。

其中Dt為發芽時間(d),Gt為與Dt相對應的發芽種子數，S為一定時期內正常幼苗的單株長度[22]。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據整理，采用SPSS 20.0軟件對所測數據統計分析，對SA和ABA處理下的扁蓿豆種子萌發指標分別進行單因素方差分析，并用LSD法對各不同濃度下種子萌發指標測定數據進行多重比較，差異顯著性水平均為0.05，采用Excel 2010制圖，所有試驗數據以平均值±標準誤表示。

采用模糊數學隸屬函數法進行SA和ABA浸種下低溫效應的綜合評價，計算發芽期和苗期6項指標的隸屬值，將其平均值作為最終評價指標。計算方法為：

Wji=(Xji-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(1)

(2)

公式(1)中Wj,i為第j,i水平指標的得分，Xj,i為第i水平第j個觀測指標值，Xjmin為第j個觀測指標的最小值，Xjmax為第j個觀測指標的最大值，n為觀測指標數，Wi為第i水平的綜合隸屬值。

2 結果與分析

2.1 SA和ABA浸種對低溫下種子初次發芽天數、發芽勢和發芽率的影響

除S8和A8外，所有處理均是第二天初次發芽，由于S8和A8處理在整個試驗期間均不萌發，因此在以下統計分析圖中均不呈現。整個發芽試驗中，未見不正常幼苗。不同濃度SA和ABA處理對扁蓿豆發芽勢和發芽率的影響趨勢均為先升后降(圖1)。SA處理中，S4下扁蓿豆發芽勢最高，但較對照差異不顯著。ABA處理中，A1～A4的濃度均促進扁蓿豆種子低溫下發芽勢的增加，其中在A3處理中達到最高為84%，較對照提高了16.7%，差異顯著(P<0.05)。

與對照組相比，SA處理中，S1，S3，S4，S5均促進扁蓿豆種子萌發且差異顯著(P<0.05)，其中在處理S4中達到最高；ABA處理中，A2是提高種子發芽率的最佳濃度，A3次之，但兩者差異不顯著，A1～A6處理均促進發芽率的增加。

2.2 SA和ABA浸種對低溫下扁蓿豆根長和芽長的影響

如圖2所示，SA和ABA對于扁蓿豆在低溫脅迫下根長和芽長的影響大體趨勢為先增后減。S1～S5濃度均促進芽伸長，各濃度之間差異不顯著，S4是促進根伸長的最佳濃度處理，較對照增加了28.78%，差異顯著(P<0.05)。A3是促進芽伸長的最佳濃度，A5次之，較對照分別增加了59.34%和45.02%，差異顯著(P<0.05)。和對芽長影響結果一致，不同ABA濃度對根長的影響也是在A3和A5處理中效果最佳,較對照增加了27.76%和29.22%(P<0.05)。

2.3 SA和ABA浸種對低溫下扁蓿豆發芽指數和活力指數的影響

如圖3所示，在SA處理中，與對照相比，S2，S4顯著提高扁蓿豆種子的發芽指數(P<0.05)，其中S4是提高種子發芽指數的最佳處理，S2次之，而S7處理較對照顯著降低71.55%(P<0.05)，降幅明顯。在ABA處理中，A1～A4處理下發芽指數較對照分別提高了9.1%～18.49%，其中A3處理下的發芽指數最高，較對照差異顯著(P<0.05)。

不同SA處理濃度對扁蓿豆的活力指數呈先增后降的趨勢，處理S1～S4種子活力指數較對照差異顯著(P<0.05)，其中處理S4增加了46.84%，是促進扁蓿豆活力指數的最佳處理,而高濃度(>20 μmol·L-1)的SA處理則抑制種子的活力指數。在ABA處理中，處理A3為最佳濃度處理，種子的活力指數較對照增加了66.74%，差異顯著(P<0.05)。

2.4 綜合評價

采用模糊數學隸屬函數法對SA和ABA各濃度處理的應用效果進行綜合評價(表1)。結果表明，A3浸種處理的效果最好，S4和A4浸種處理效果較好，綜合隸屬平均值位于第2和第3。較CK而言，S1～S6和A1～A5浸種處理均能促進低溫下種子的萌發，S7，A6和A7浸種處理均抑制種子萌發。

圖2 不同SA和ABA浸種對扁蓿豆根長和芽長的影響Fig.2 Effects of soaking seeds with different SA and ABA on root length and bud length of Medicago ruthenica

圖3 不同SA和ABA浸種對扁蓿豆發芽指數和活力指數的影響Fig.3 Effects of soaking seeds with different SA and ABA on germination index and vigor index of Medicago ruthenica

表1 不同SA和ABA浸種對低溫條件下扁蓿豆種子萌發的綜合評價Table 1 Comprehensive evaluation of soaking seeds with different SA and ABA on germination of Medicago ruthenica at low temperature

3 討論

3.1 SA和ABA浸種對低溫下扁蓿豆種子萌發的影響

種子萌發及根長和芽長對環境脅迫表現敏感，因此對于大多數植物而言，常用這兩種指標表現來評價植物的抗逆性[23]。種子萌發的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數是種子生命力和幼苗長勢的重要表征指標[24]，出苗期低溫會抑制種子的萌發、減緩發芽速率、降低發芽勢和發芽率，導致幼苗長勢參差不齊[25]。在植物遭受低溫脅迫時，SA通過抑制脂膜過氧化來維持細胞完整性，從而抵御逆境[26-27]。ABA是植物應答外界逆境的重要調節因子，在逆境下，植物體會增加ABA的合成，外源施用ABA通過提高植株自身ABA的合成和轉運，誘導植物滲透調節劑含量的增加，提高細胞膜穩定性，從而提高植物的抗寒性[28-29]，而SA和ABA誘導植物防御低溫的效果取決于其濃度和應用模式[30]。

在本研究中，低溫條件下扁蓿豆種子的4種萌發指標均隨著不同外源物質濃度的增加呈先升后降的趨勢，這與武季玲和陳桂平[31]在對植物抗冷性的研究得出的結果一致。在不同SA處理濃度中，以5 μmol·L-1為最佳處理濃度，其發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數分別較CK提高了3.71%，7.33%，11.24%，46.84%，表明適當濃度的SA可以有效促進扁蓿豆種子的萌發，且使其保持較高的活力。楊小環等[32]對低溫脅迫下玉米進行浸種后發現，與對照相比，SA處理下玉米的發芽勢提高了33.34%，其增幅遠大于本研究SA浸種對發芽勢的增加，可能原因是玉米作為喜溫作物，在低溫條件下更容易受到冷害，對于外源物質更具敏感性。藜豆(Stizolobiumcapitatum)[33]、黑麥草(Loliumperenne)[34]對SA緩解低溫冷害的最佳濃度均為1.5 mmol·L-1，提高煙草[35]抗冷性的最佳濃度為0.5 mmol·L-1。與它們不同的是本研究在>20 μmol·L-1的SA溶液中種子萌發已顯示抑制作用，表明不同植物緩解低溫冷害時的SA最佳濃度不同。此外，本試驗表明，0.05 μmol·L-1的ABA溶液可以有效緩解扁蓿豆的低溫脅迫，提高其萌發特性。>1 μmol·L-1的ABA浸種濃度對扁蓿豆的發芽特性產生顯著抑制作用，這與徐文玲等[36]所研究的ABA在低濃度下提高大白菜(Brassicapekinensis)抗寒性的報道、楊曉娟等[16]對于冬油菜的種子萌發特性探討均吻合。對于ABA浸種處理在發芽勢和發芽率上出現的濃度差異，A3處理下發芽勢最高，A2處理下發芽勢較A3低，但發芽率高，可能原因是ABA在A3處理的較高濃度下促萌發作用顯著，發芽較快。A5和A6處理顯著抑制發芽勢的增加，但發芽率與對照差異不顯著，可能由于過高濃度的ABA抑制種子的發芽速度和發芽整齊度。最后，兩種浸種劑均未對扁蓿豆初次發芽天數產生影響，與左志梅等[37]的研究結果相符，與丁軍輝等[38]研究發現的10 mg·L-1的ABA在萌發第1 d對水稻(Oryzasativa)種子‘LP04’有顯著促進的結論存在差異，其原因可能是水稻在低溫下較扁蓿豆對ABA更具敏感性。最后，對于本研究中100 μmol·L-1的SA和5 μmol·L-1的ABA的處理濃度使得扁蓿豆的發芽率為0，可能原因是過高濃度的SA和ABA溶液對植物細胞的正常代謝造成影響，降低了種子滲透調節能力，從而不利于種子吸水或對其產生毒害作用[39]。因此，有必要針對不同植物選擇適宜SA和ABA處理濃度，以便更有效地提高植物的抗逆能力[40]。

3.2 SA和ABA浸種對低溫下扁蓿豆種子苗長的影響

植株幼苗的長度能體現植株生長速度和強壯程度。幼苗在遭受持續性低溫時，表現為生長緩慢甚至停滯、根系生長受到抑制、葉片萎蔫，嚴重時導致植株死亡[41]。適量的水楊酸或脫落酸會使得植物產生系統獲得性抗性，促進脅迫下植物的生長速率，調節離子吸收與轉運、促進根系生長，從而抵御外界環境脅迫，但高濃度的外源物質會使植物發生超敏反應，引起植物細胞程序性死亡，從而抑制植物生長[42]，所以，適宜的外源物質濃度的確定對于植物抵御不利環境有重要作用。本研究結果表明，低濃度SA和ABA浸種均能促進低溫下扁蓿豆種子的芽和根伸長，這與王星劍等[43]在對茄子(Solanummelongena)的研究中體現出的“劑量效應”一致。在本研究中，SA處理中0.1～10 μmol·L-1之間的濃度均對扁蓿豆根長和芽長有促進作用，濃度適宜范圍較廣，與呂旭才等[44]對油菜(Brassicanapus)種子的研究結果一致。0.05 μmol·L-1ABA使低溫條件下扁蓿豆芽長增加了59.34%，而根長在0.05和0.5 μmol·L-1的浸種溶液中均增加了27.76%和29.22%，表明芽伸長對ABA反應比根敏感，這與劉晶等[45]對蓖麻(RicinusCommunis)種子的研究中根長較芽長敏感的結論不同，但與鄭世英等[46]的研究結果一致，其結果表明，SA緩解了鹽脅迫下玉米種子的發芽情況，且對芽長的緩解作用大于對根長的緩解作用，這可能是不同植物的生長環境差異所致。此外，湯日圣等[47]在ABA對水稻種子萌發探索中發現，ABA抑制根和芽的伸長，而在干旱脅迫下ABA處理均能促進其種子萌發初期根和芽的伸長，這也證實ABA能緩解逆境條件下種子萌發和早期幼苗伸長的結論。同時，對于本研究在低溫條件下，SA和ABA處理對扁蓿豆種子發芽率的影響比其根長和芽長的影響小，原因是可能扁蓿豆在經過濃硫酸處理后本身具有較高的發芽率，低溫對于扁蓿豆的影響主要表現在幼苗上，且由于外源物質在抵御逆境過程中對誘導植物幼苗產生蛋白更有效，外源物質的添加會使種子發芽初期分泌更多滲透物質，因此對根和芽的伸長效果更為顯著[12]，這對于春季高寒草甸扁蓿豆的建植和增強其幼苗素質有積極作用。李靈芝等[48]等研究中證實，1 mmol·L-1的SA對于黃瓜(Cucumissativus)‘新夏豐2號’種子的發芽率較對照增加了14.81%，根長和芽長分別增加了27.88%和30.66%，這與本試驗結果一致，表明較種子發芽率而言，外源物質浸種處理更具促進根和芽伸長的作用。

本研究各個指標通過模糊數學中隸屬函數分析進行SA和ABA對低溫效應的綜合評價，避免了單個指標的片面性。經隸屬函數分析后結果顯示，0.05 μmol·L-1的ABA浸種處理是提高扁蓿豆種子萌發的最佳濃度。這與劉麗杰等[49]對寒地冬小麥(Triticumaestivum)的研究報告中顯示SA單獨浸種效果好于ABA不同，可能與不同植物對于外源激素的敏感性不同有關。本試驗僅對單獨浸種劑對種子萌發特性的影響作了探索，而對于復合浸種劑及其對低溫下扁蓿豆發芽和幼苗生長的研究有待深入。

4 結論

0.05 μmol·L-1的ABA浸種處理顯著提高低溫下扁蓿豆種子發芽勢和活力指數，低濃度的SA和ABA對種子發芽率和發芽指數均有提高，高濃度表現為抑制作用。

與萌發指標相比，SA和ABA浸種處理對根長和芽長的促進作用較大，且芽較根敏感，綜合考慮其萌發指標，0.05 μmol·L-1的ABA浸種處理是低溫下提高扁蓿豆種子萌發和幼苗初期生長的最佳濃度。