PEG干旱脅迫對3種蔥屬植物種子萌發期滲透調節物質及酶活性的影響

秦立剛，李 雪，李韋瑤，胡 堯，李 俊，崔國文*

(1. 東北農業大學動物科學技術學院, 黑龍江 哈爾濱, 150030； 2. 中國農業科學院草原研究所, 內蒙古 呼和浩特, 010000)

蔥屬植物(AlliumL.)大多數是多年生草本植物，鱗莖呈圓柱形狀，部分呈圓球形狀，且具有膜質、革質或纖維質鱗莖皮[1]。蔥屬植物分布廣泛，具有藥用、食用和觀賞價值[2]。野韭(AlliumramosumL.)、山韭(AlliumsenescensL.)和蒙古韭(AlliummongolicumRegel)在我國東北地區屬于常見的野生蔥屬植物，且都具有很高的藥用和食用價值[3-5]。由于全球氣候變化的影響，干旱變成了全世界面臨的一個重要問題，也是我國農林產業發展的主要限制因素之一[6]。黑龍江省地處我國東北部，由于地形和氣候影響多為干旱半干旱土地，每年受干旱面積多達37.5萬hm2。因此，從野生鄉土植物資源角度，篩選適生的抗旱草本植物[7]，對于該地區的植被快速恢復有主要意義。野生蔥屬植物在東北地區適應性較強，在沙石地也可大量繁殖，具有較強的抗旱性，可在干旱半干旱地區的植被恢復中進行廣泛應用。

干旱脅迫下植物細胞膜透性被破壞[8]，相對電導率升高，并且隨著細胞脫水，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和脯氨酸不斷積累，可溶性糖和可溶性蛋白含量也會持續升高[9]。但植物可以產生自我保護的抗氧化酶，這些酶可以維持活性氧的動態平衡[10]。在抗氧化酶系統中，植物在響應干旱脅迫時以超氧化物歧化酶(Superoxide,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)為主[11]，SOD，CAT和過氧化物酶(Peroxidase,POD)是主要作用酶[12]。多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)能通過分子氧氧化酚和多酚形成醌類化合物，構成植物的保護性屏障[13]。種子萌發和幼苗生長是植物生長的關鍵階段，萌發期間種子耐旱性更能反映植物的抗旱性[14]。因此，本試驗通過測定3種蔥屬植物種子萌發期滲透調節物質及酶活性指標的變化，通過主成份分析及隸屬函數分析對其進行耐旱性評價，為東北地區旱區蔥屬植物的人工馴化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山韭種子來自東北農業大學草業科學實驗室，野韭和蒙古韭種子來自中國農業科學院草原研究所。

1.2 試驗設計

試驗采用培養皿濾紙萌發法，分別選取山韭、野韭和蒙古韭3種植物的飽滿均一的種子，放置于0.5%的高錳酸鉀消毒液中消毒5 min，然后將種子在去離子水下沖洗干凈，晾干備用。試驗采用不同濃度的PEG-6000溶液模擬干旱條件，按照濃度0(CK)、5%(質量分數，下同)、10%，15%，20%，30%設置6個處理[15]，其中CK為去離子水處理，各處理均重復3次。在培養皿底層鋪2層濾紙，分別加入10 mL不同濃度梯度的PEG-6000溶液或去離子水，再將消毒過的種子均勻放置于培養皿中，每個培養皿中放置100粒。將培養皿置于26℃下培養。每72 h更換一次濾紙和溶液，確保種子所處的溶液濃度不變。培養2～3 d開始觀察種子的萌發情況。當胚根開始突破種皮的時候作為種子萌發初期，萌發3 d后進行取樣測定。

1.3 測定指標與方法

相對電導率使用DDS-11A型數字顯示電導儀測定。滲透調節物質及酶活性均采用索萊寶生物科技有限公司試劑盒進行測定，其中：MDA含量測定使用試劑盒BC0020，脯氨酸含量使用試劑BC0290，可溶性糖含量使用試劑盒BC0030，可溶性蛋白含量測定使用試劑盒BC1720，SOD活性測定使用試劑盒BC0170，CAT活性測定使用試劑盒BC0200，POD活性測定使用試劑盒BC0090。

1.4 統計方法

利用Excel 2010 進行數據整理和作圖。采用SPSS軟件對各指標進行0.05水平下多重比較和方差分析，并進行主成分分析。采用隸屬函數法對3種蔥屬植物進行耐旱性綜合比較[16]，各指標權重由主成分分析得到。不同蔥屬植物各測定指標的隸屬函數計算公式如下：X(ab)=[Xab-Xbmin]/[Xbmax-Xbmin]。式中：X(ab)為a材料b指標在某一處理下的隸屬值。Xbmax為該處理下b指標測定的最大值，Xbmin為該處理下b指標測定的最小值，如果a為負指標則用如下公式：X(ab)=1-[Xab-Xbmin]/[Xbmax-Xbmin]。然后把b指標在各個處理下的隸屬值相加，求其平均值即可得出a材料b指標的隸屬函數值。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對種子萌發期滲透調節物質的影響

2.1.1干旱脅迫下相對電導率的變化 隨著PEG濃度的升高，3種植物種子的相對電導率呈持續上升的趨勢(圖1)。山韭在PEG濃度30%，蒙古韭和野韭在PEG濃度20%和30%時，相對電導率顯著高于其他PEG濃度(P<0.05)，并均在PEG濃度30%時達到最大值，表明隨著干旱脅迫的加強，3種植物均受到了較大的影響。在PEG濃度20%時，野韭相對電導率顯著高于其他兩種植物(P<0.05)，山韭相對電導率最低，表明在此干旱脅迫程度下，山韭受到的影響最小。PEG濃度在30%時，野韭相對電導值仍最高(P<0.05)，山韭和蒙古韭相對電導率無顯著差異，但山韭較低于蒙古韭。

圖1 PEG-6000脅迫下相對電導率的變化Fig.1 Changes of relative conductivity under different PEG-6000 concentrations注：不同大寫字母表示同種不同PEG濃度下差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一PEG濃度不同種間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different uppercase letters indicated significant differences in different PEG concentrations of the same species at the 0.05 level,while different lowercase letters indicated significant differences in different species of the same PEG concentration at the 0.05 level. The same as below

2.1.2干旱脅迫下MDA含量的變化 隨著PEG濃度的升高，3種蔥屬植物種子的MDA含量呈先上升后下降的趨勢(圖2)。PEG濃度在15%和20%時，3種植物的MDA含量顯著高于其他PEG濃度(P<0.05)，并均在PEG濃度20%時達到最大值，分別為：野韭67.36 nmol·g-1FW，山韭51.14 nmol·g-1FW，蒙古韭62.27 nmol·g-1FW，表明隨著干旱脅迫的加強，3種植物均受到了較大的影響。野韭MDA含量在PEG濃度20%，15%，5%，30%和對照處理下，均存在顯著差異，表明野韭在受到干旱脅迫時，MDA含量的變化表現的更加敏感。山韭的MDA含量在各處理下均低于其他兩種植物，說明其受到的干旱脅迫影響較小。

2.1.3干旱脅迫下脯氨酸含量的變化 隨著PEG濃度的升高，3種植物的脯氨酸含量均呈現先上升后下降的趨勢(圖3)。但3者變化程度不同，蒙古韭在PEG濃度10%時達到最大值，為134.71 μg·g-1，野韭和山韭在PEG濃度15%時達到最大值，分別為97.15 μg·g-1和158.34 μg·g-1。3種植物相比，在PEG濃度10%時，野韭脯氨酸含量顯著低于另外兩者(P<0.05)，山韭脯氨酸含量最高。在PEG濃度為15%,20%和30%時，山韭脯氨酸含量顯著高于其他兩種植物(P<0.05)，說明在這3種處理下山韭的脯氨酸含量的變化表現得更加敏感。

圖2 PEG-6000脅迫下MDA含量的變化Fig.2 Changes of MDA content under different PEG-6000 concentrations

圖3 PEG-6000脅迫下脯氨酸的含量變化Fig.3 Changes of proline content under different PEG-6000 concentrations

2.1.4干旱脅迫下可溶性糖含量的變化 隨著PEG濃度的升高，3種植物種子的可溶性糖含量均呈現先上升后下降的趨勢(圖4)。PEG濃度在15%時，3種植物可溶性糖含量均達到最高，分別為：野韭5.13 mg·g-1，山韭6.82 mg·g-1，蒙古韭5.91 mg·g-1。3種植物相比，在PEG濃度15%時，山韭可溶性糖含量顯著高于其他兩種植物(P<0.05)，野韭可溶性糖含量最低(P<0.05)，說明在PEG-6000(濃度為15%)脅迫下，山韭具有更好的滲透調節能力。

2.1.5干旱脅迫下可溶性蛋白含量的變化 隨著PEG濃度的升高，3種植物種子可溶性蛋白含量均呈現先上升后下降的趨勢(圖5)。PEG濃度在15%時，3種植物可溶性蛋白含量顯著高于其他PEG濃度(P<0.05)，并均此時達到最大值，分別為：野韭0.34 mg·g-1，山韭0.37 mg·g-1，蒙古韭0.36 mg·g-1，表明隨著干旱脅迫的加強，3種植物均受到了較大的影響。在PEG濃度為15%時，山韭可溶性蛋白含量顯著高于其他兩種植物(P<0.05)，野韭可溶性蛋白含量最低(P<0.05)。

圖4 PEG-6000脅迫下可溶性糖的含量變化Fig.4 Changes of soluble sugar content under different PEG-6000 concentrations

圖5 PEG-6000脅迫下可溶性蛋白的含量變化Fig.5 Changes of soluble protein content under different PEG-6000 concentrations

2.2 干旱脅迫對種子萌發期酶活性的影響

2.2.1干旱脅迫對SOD活性的影響 隨著PEG濃度的升高，3種植物種子的SOD活性均呈現先上升后下降的趨勢(圖6)。PEG濃度在10%時，3種植物SOD活性顯著高于其他PEG濃度(P<0.05)，并均此時達到最大值，分別為：野韭106.26 U·g-1FW·min-1，山韭128.56 U·g-1FW·min-1，蒙古韭113.15 U·g-1FW·min-1。3種植物相比，在PEG濃度10%時，山韭SOD活性最高，顯著高于野韭(P<0.05)。

2.2.2干旱脅迫對CAT活性的影響 隨著PEG濃度的升高，3種植物種子的CAT活性均呈現先上升后下降的趨勢(圖7)。在PEG濃度10%和15%時，山韭和蒙古韭CAT活性顯著高于其他PEG濃度(P<0.05)，并且野韭和山韭的CAT活性在PEG濃度為15%時達到最大值，分別為：野韭58.34 U·g-1FW·min-1，山韭61.25 U·g-1FW·min-1。蒙古韭的CAT活性在PEG濃度為10%時達到最大值113.15 U·g-1FW·min-1。在PEG濃度10%時，山韭和蒙古韭CAT活性顯著高于野韭(P<0.05)。在PEG濃度為15%時，野韭和山韭CAT濃度顯著高于蒙古韭(P<0.05)。

圖6 不同PEG-6000濃度下SOD的活性變化Fig.6 Changes of SOD activity under different PEG-6000 concentrations

圖7 不同PEG-6000濃度下CAT的活性變化Fig.7 Changes of CAT activity at different PEG-6000 concentrations

2.2.3干旱脅迫對POD活性的影響 隨著PEG濃度的升高，3種植物種子的POD活性均呈現先上升后下降的趨勢(圖8)。PEG濃度在10%和15%時，3種植物POD活性顯著高于其他PEG濃度(P<0.05)，并且山韭和蒙古韭的POD活性在PEG濃度為10%時達到最大值，分別為：山韭182.27 U·g-1FW·min-1，蒙古韭134.72 U·g-1FW·min-1。野韭的POD活性在PEG濃度為15%時達到最大值為：121.32 U·g-1FW·min-1。3種植物相比，山韭在各PEG濃度處理下POD活性均顯著高于其他兩種植物(P<0.05)。表明山韭在受到干旱脅迫時，POD活性較野韭和蒙古韭顯著提高，表現出較強的抗氧化能力。

圖8 不同PEG-6000濃度下POD的活性變化Fig.8 Changes of POD activity at different PEG-6000 concentrations

2.2.4干旱脅迫對PPO活性的影響 隨著PEG濃度的升高，3種植物種子的PPO活性均呈現先上升后下降的趨勢(圖9)。PEG濃度在10%和15%時，3種植物PPO活性顯著高于其他PEG濃度(P<0.05)，并均在PEG濃度10%時達到最大值，分別為：野韭3.11 U·g-1FW·min-1，山韭3.43 U·g-1FW·min-1，蒙古韭3.48 U·g-1FW·min-1。在PEG濃度15%時，山韭的PPO活性顯著高于其他兩種植物(P<0.05)。

圖9 不同PEG-6000濃度下PPO活性變化Fig.9 Changes of PPO activity under different PEG-6000 concentrations

2.3 滲透調節物質與酶活性應對干旱脅迫的主成分分析

如表1所示，對3種蔥屬植物種子在PEG模擬干旱脅迫下滲透調節物質和酶活性進行主成分分析。第一主成分和第二主成分累積貢獻率達到80.38%，可以綜合反映抗旱性指標的絕大部分信息，因此利用主成分分析方法來研究3種蔥屬植物抗旱能力是可行的。

如圖10(A)所示，各指標之間的距離反映了各指標的相關性，其中，SOD，POD，CAT和PPO活性之間距離較近，顯示出較強的相關性，可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量之間相關性也較強，并與MDA具有一定的相關性。由圖10(B)可以看出，在0和5%PEG濃度下3種蔥屬植物均聚集在第三象限，10%PEG濃度下的3種蔥屬植物聚集在第四象限，15%PEG濃度下3種蔥屬植物和20%濃度下的山韭均聚集在第一象限，20%濃度下野韭、蒙古韭和30%濃度下3種蔥屬植物均已聚集在第二象限。

綜合來看，未干旱和干旱初期(5%PEG濃度)，蔥屬植物滲透調節物質和酶活性均未發生顯著變化。在10%PEG濃度的干旱脅迫下，3種蔥屬植物主要通過調節4種酶活性來應對干旱脅迫。隨著PEG濃度的增加，3種植物在15%PEG濃度下和山韭在20%PEG濃度下，可溶性糖、可溶性蛋白、MDA和脯氨酸在應對干旱脅迫中起主要作用。20%PEG濃度下野韭和蒙古韭、30%PEG濃度下3種蔥屬植物相對電導率均有顯著的變化。同時，野韭與蒙古韭整體較為接近，其抗旱能力相似，山韭抗旱能力相比其他兩種蔥屬植物更強。

2.4 抗旱能力綜合評價

蔥屬植物抗旱能力并非由單一指標決定，因此，本研究通過對5種滲透調節物質和4種酶活性指標進行隸屬函數分析，對3種蔥屬植物種子萌發期抗旱能力進行綜合評價。其中，各個指標的權重通過以上主成分分析得出。分析7個測定指標的隸屬函數值，進而得到3種蔥屬植物種子萌發期耐旱隸屬函數加權平均值(表2)。其中以山韭得分最高，蒙古韭得分最低。抗旱能力強弱順序依次為：山韭>野韭>蒙古韭，與主成分分析結果基本一致。

3 討論

干旱脅迫發生時，植物細胞膜易受到損傷，導致質膜透性增大，細胞內含物外滲[17-18]，外滲液電導率增大，且質膜損傷程度越大，電導率越高[19]。干旱脅迫下3種蔥屬植物種子萌發期相對電導率與對照相比均有所升高。當PEG濃度為30%時，野韭種子相對電導率最高，而相同條件下，山韭與蒙古韭種子電導率的增加幅度顯著低于野韭種子。由此可以看出，在干旱脅迫發生時野韭種子的膜損傷程度最大，而山韭和蒙古韭種子的膜損傷程度相比之下更輕一些。

表1 方差分解主成分Table 1 Variance decomposition of principal components

圖10 主成分分析圖Fig.10 Principal component analysis diagram注：圖(A)為因子載荷圖，圖(B)為樣品得分圖Note:Figure (A) is the factor load diagram,and figure (B) is the sample score chart

表2 3種蔥屬植物種子萌發期指標隸屬值及抗旱性綜合評價Table 2 Seed germination index and drought resistance comprehensive evaluation of 3 Allium L. species

MDA是植物細胞膜脂過氧化物之一，能與細胞內多種成分發生反應引起細胞的嚴重損傷，MDA的含量可以側面反映非生物脅迫下植物細胞的受損情況[20-21]。3種蔥屬植物種子的MDA含量均在PEG濃度為20%時達到最高，而在30%的PEG濃度下3種植物種子的MDA含量又有所下降，這可能是由于植物中的保護酶作用使MDA含量下降，從而保護植物應對干旱脅迫。這與李州等關于不同葉型白三葉(TrifoliumrepensL.)抗氧化保護及滲透調節生理對干旱脅迫的響應的研究結果相一致[22]。脯氨酸是調節植物水分脅迫條件下細胞水勢的物質之一，脯氨酸對干旱脅迫十分敏感。干旱脅迫條件下脯氨酸含量往往和對照相比會有所上升，脯氨酸含量的積累反映了植物對不良環境的忍耐能力[23]。3種植物中在多數處理下山韭的脯氨酸含量都要高于同處理下的另外兩種植物種子。另外隨著PEG濃度的升高，3種植物種子的脯氨酸含量均呈現先上升后下降的趨勢，這一趨勢與MDA的變化趨勢相似。根據滲透調節物質的主成分分析可以看出脯氨酸和MDA具有一定程度的相關性。可溶性糖和可溶性蛋白是植物在干旱脅迫下重要的滲透調節物質，當滲透脅迫來臨時會顯著增加，以增強植物的抗旱能力[24]。當PEG濃度為15%時，3種植物的可溶性糖和可溶性蛋白含量最高，此時山韭種子的可溶性糖和可溶性蛋白含量要顯著高于另外兩種植物，結合山韭種子在干旱脅迫下的脯氨酸和MDA含量可以得出：山韭種子在干旱脅迫下滲透調節物質的含量最高，可以有效地調節細胞滲透勢，對于植物細胞的保護能力最強。

在植物的抗氧化防御系統中，SOD催化超氧化物的歧化反應，減輕活性氧對植物細胞的毒害作用。研究表明，提高SOD酶活性對植物抗旱具有關鍵性作用，較高的SOD活性能夠有效的清除過量積累的活性氧，從而提高植物的抗旱性[25]。植物在逆境脅迫下，會產生有毒有害物質，CAT作為細胞中的抗氧化防御酶，在植物受外界環境脅迫時可以清除由于植物體內的過氧化氫，是植物重要的保護酶之一[26]。POD主要通過催化分解H2O2或其他過氧化物來氧化底物，從而清除體內活性氧和參與體內代謝活動，是生物體內重要的抗氧化酶之一[27]。POD的表達和活性與植物的抗逆性密切相關。有研究表明，植物通過增強抗氧化酶活性及增強活性氧代謝來增強植物耐受性[28]。在本試驗中，隨著PEG濃度的增加3種植物的SOD，CAT和POD活性的變化趨勢較為一致，都呈現先上升后下降的趨勢。這一結果與陳愛萍[29]等關于伊犁絹蒿(Seriphidiumtransiliense)幼苗在干旱脅迫下通過積累滲透調節物質和提高抗氧化酶活性維持生長的試驗結果相一致。通過本文中酶活性應對干旱脅迫的主成分分析可以看出3種保護酶距離較近，具有較強的相關性。

PPO與植物抗逆作用有極大的關系。衰老、逆境脅迫以及病原菌、病蟲侵害都能引起PPO活性的變化[30]。PPO在發揮作用的過程中會與酚類物質作用，酚類物質的積累被認為與植物抵御非生物脅迫有關，在冷脅迫、水分脅迫和熱脅迫條件下均觀察到該現象，這些酚類物質與抑制PPO活性、增加抗氧化酶和自由基清除劑酶活性相關[31]。在本試驗中，3種蔥屬植物種子中PPO活性的變化趨勢大致相同，只是野韭和蒙古韭種子中PPO的活性在PEG-6000濃度為20%是迅速下降，而山韭種子中的PPO活性在30%時才發生顯著下降。另外PPO與SOD，POD和CAT之間距離較近，同樣也顯示出了較強的相關性。

4 結論

干旱脅迫下，3種蔥屬植物種子萌發期丙二醛含量、相對電導率、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性和對照相比均顯著上升；在干旱脅迫發生時野韭種子的膜損傷程度最大。山韭種子在干旱脅迫下滲透調節物質的含量最高。SOD，POD，CAT和PPO活性之間顯示出較強的相關性，可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量之間相關性也較強，并與MDA含量具有一定的相關性。通過隸屬函數分析得出3種植物種子的抗旱性由高到低依次為：山韭>野韭>蒙古韭。