異齡老芒麥根際土壤中脂肪酸類物質檢測及根際土壤的自毒效應研究

楊 航，祁 娟，劉文輝，劉艷君，宿敬龍，李 明

(1. 甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續研究中心，甘肅 蘭州 730070；2. 青海省畜牧獸醫科學院，青海省青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室，青海 西寧 810016)

自毒作用是導致連作障礙的主要因素之一[1]。植物在生長過程中，通過根系向土壤中釋放一些有毒物質抑制自身或種內植物生長發育[2]，這些物質包括有機酸類、脂類、烴類、苯類等[3]。研究表明，蘭州百合(Liliumdavidiivar. unicolor salisd)根系分泌物中鑒定出棕櫚酸、抗氧化劑2246和高根二醇等物質[4]，且不同連作年限根際土壤浸提液會抑制百合幼苗的生長[5]；不同種植年限的紫花苜蓿(MedicagosativaL.)土壤中自毒物質的種類與含量有顯著差異，且其水浸提液會對其種子萌發產生抑制作用[6,7]。馬瑞霞等[8]利用氣質聯用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技術從小麥(TriticumaestivumL.)殘體中分離出酚酸類化感物質，亦對其種子萌發產生明顯的抑制效果；聶銘[9]研究表明，種植地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)土壤中自毒物質含量隨著種植年限的增長呈現出先增加后減少的趨勢。

近年來，隨著畜牧業的發展，飼草料缺乏問題日益顯著，人工草地建植是解決畜牧業發展的關鍵途徑[10]。老芒麥(ElymussibiricusL.)是禾本科披堿草屬多年生牧草，具有抗逆性強、產草量高、適口性好等特點[11]，常用于人工草地的建植和退化草地的修復。但多年的實踐證明，老芒麥的利用年限較短，有研究表明，披堿草屬人工草地在建植第4年以后開始衰退，在封育條件下，種群生產力在第4年也會開始下降，第7年嚴重退化[12]，有研究表明連作會抑制植物的生長，致使植物生產力下降[13]。目前，關于調控老芒麥種群易衰退的主要因子研究偶見報道[14-16]，但關于連作障礙對老芒麥生長的影響研究鮮見報道。為此，本研究以不同種植年限‘青牧一號’老芒麥根際土壤為研究對象，通過GC-MS檢測方法，分析老芒麥根際土壤中脂肪酸酯類物質的種類與含量變化規律，并進一步研究不同年限土壤浸提液對老芒麥種子萌發的影響，以明確連作障礙與自毒效應是否為影響老芒麥生長發育的因素之一，旨在避免自毒效應給老芒麥人工草地建植帶來損失，同時為老芒麥人工草地建植提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地概括

試驗地位于青海省海北州海晏縣國家草品種區域試驗中心，坐標為100°85′E，36°45′N，平均海拔3 154 m。寒冷期長，無絕對霜期，最高氣溫31℃，最低氣溫-33℃，年均溫0.6℃。年降水量集中在7，8，9月份，為369～403 mm，全年干濕季節分明，雨熱同期，年均蒸發量在1 435 mm左右，無霜期約90 d。

1.2 根際土壤采集

于2019年9月初，在已建植3年、4年、5年和8年的‘青牧一號’老芒麥人工草地中分別挖取長勢均勻的老芒麥根系，參照盧豪良等[17]方法，先抖落表面土壤，后用毛刷輕輕刷掉根表面大約5 mm的土壤，裝入密封袋，寫明標簽，帶回實驗室冷藏保存。

1.3 脂肪酸提取

將所采集到的4種年限土壤晾干后研磨過0.25 mm篩，然后稱取0.5 g至10 mL的離心管中，每個年限做3次重復，進行以下操作。

(1)每個離心管中加入5 mL的色譜甲醇浸泡2小時，10 000 r·min-1離心10 min，提取2次合并上清液。

(2)再加入5 mL的三氯甲烷混勻后浸泡2小時，10 000 r·min-1離心10 min，用注射器過濾，提取2次合并上清液。

(3)將步驟(1)(2)中的提取液各取2.5 mL至離心管中混勻，用氮吹儀吹干。

(4)在經過氮吹儀的離心管中加入5%氫氧化鉀-甲醇溶液1 mL，搖勻，在60℃水浴加熱30 min，取出冷卻至室溫。

(5)后加入3 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，搖勻，在60℃水浴加熱3 min，取出冷卻至室溫。

(6)最后加入2 mL正己烷，充分振蕩，靜置，取上清液于GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析條件

氣象色譜儀：安捷倫7890A-5975CMS氣相色譜質譜聯用儀。安捷倫毛細管DB-225 ms(規格為30 m×0.25 mm×0.25 μm)。進樣口溫度：280℃，分流比 20：1；升溫程序：初始溫度為50℃，保持5℃·min-1升溫至 200℃，再以2℃·min-1升溫至230℃，保持10 min。載氣：He，載氣流量：1 mL·min-1；進樣量1 μL。離子源溫度為230℃，四級桿溫度150℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描質量范圍為35～800 μ。

1.5 土壤浸提液制備

將所采集到的已種植老芒麥3，4，5和8年的根際土壤晾干后研磨過0.25 mm篩，分別稱取5，10，20和50 g各年限根際土壤置于三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，用保鮮膜封口，在30℃的超聲波中萃取30 min，然后在25℃，150 r·min-1的條件下震蕩浸提24 h，振蕩完后過濾浸提液，最后將浸提液定容為100 mL，各年限根際土壤分別配置成50，100，200，500 g·L-1浸提液，于4℃保存備用。

1.6 種子發芽試驗與測定指標

選取大小一致、飽滿無病害的‘青牧一號’老芒麥種子，用78%的酒精浸泡1 min，然后用蒸餾水沖洗至無酒精味，用濾紙吸干表面水分。采用培養皿紙上發芽法，在直徑為9 cm的一次性培養皿中鋪雙層濾紙，每個培養皿均勻擺放30粒老芒麥種子，加入上一步制備的土壤浸提液5 mL，共16個處理，3次重復。培養皿蓋上蓋子，置于溫度為25℃，光強6 000 lx，相對濕度75%，光周期14 h，暗周期10 h的光照培養箱中，每天補充適量根際土壤浸提液保證濾紙濕潤。

測定指標：參考祁娟等[18]方法，以胚根伸出種皮2 mm作為萌發標準，在發芽第5天測定發芽勢，第12天測定種子發芽率，同時，每個處理隨機選取10株幼苗，在坐標紙上測定胚芽和胚根長。用以下方法計算不同處理的種子發芽勢和發芽率。

發芽勢=發芽試驗5天內供試種子的發芽數/供試種子數×100%；

發芽率=發芽試驗12天內供試種子的發芽數/供試種子數×100%。

1.7 數據統計分析

利用SPSS 19.0軟件對老芒麥種子發芽率、發芽勢、胚芽長、胚根長指標數據進行方差分析和顯著性比較(P<0.05)，并對年限、濃度及其互作效應進行雙因素分析，利用Microsoft Excel 2010進行綜合處理和繪圖。

2 結果分析

2.1 不同種植年限老芒麥根際土壤脂肪酸酯類物質的檢測

對不同種植年限老芒麥根際土壤采用正丁烷提取法，提取物通過GC-MS分析，得到總離子流圖(圖1)，與標準物質譜圖對比，若兩者匹配度大于95%，即可鑒定出此物質。根據總離子流圖，分析得到4種不同年限土壤的脂肪酸酯類物質含量(表1)。結果顯示，4個不同年限的根際土壤中均檢測出10種物質。就脂肪酸酯類物質總量而言，5齡老芒麥的根際土壤中相對含量較高，為50%，8齡中較低，為41%，3和4齡根際土壤中脂肪酸酯類物質總量分別為48%和45%。

硬脂酸甲酯是4個不同年限土壤中占比最大的物質，分別占3，4，5和8齡土壤中脂肪酸酯類總量的39%，42%，42%和41%，棕櫚酸甲酯占脂肪酸酯類物質總量的29%，33%，31%和32%。3齡的根際土壤中，棕櫚油酸甲酯、亞油酸甲酯和r-亞麻酸甲酯顯著高于其他3個年限土壤(P<0.05)，其中，棕櫚油酸甲酯較4，5和8齡土壤分別高出98%，62%和58%，亞油酸甲酯分別高出47%，17%和75%，r-亞麻酸甲酯分別高出51%，127%和217%。棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯含量會隨著種植年限的升高呈現先升高后降低的趨勢，且都在5齡的時候達到較大值，其棕櫚酸甲酯含量顯著高于8齡土壤(P<0.05)，較8齡土壤高出17%，硬脂酸甲酯含量較3，4和8齡土壤分別高出12%，10%和23%(P<0.05)。

2.2 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對其種子萌發及幼苗生長的影響

2.2.1不同年限老芒麥土壤浸提液對其種子發芽率的影響 由圖2可知，不同年限土壤浸提液與不同濃度浸提液處理會對老芒麥種子發芽率造成不同的影響，3齡老芒麥根際土壤浸提液在200 g·L-1的濃度下發芽率較高，為69%，在5齡且濃度為500 g·L-1的浸提液處理下發芽率較低，僅為45%；4齡老芒麥根際土壤浸提液下，發芽率會隨著浸提液濃度的升高而先升高后下降，且500 g·L-1濃度下顯著低于其他3個處理(P<0.05)；5齡老芒麥根際土壤浸提液處理下，發芽率隨著浸提液濃度的升高而下降，50 g·L-1處理下顯著高于200和500 g·L-1(P<0.05)，較100，200和500 g·L-1處理下發芽率分別提高了6%，27%和44%；在8齡老芒麥根際土壤浸提液處理下，發芽率同樣隨著浸提液濃度升高而下降，200和500 g·L-1濃度處理下顯著低于50 g·L-1處理(P<0.05)，較50 g·L-1處理分別降低了17%和24%。在浸提液濃度為200 g·L-1處理下，發芽率會隨著年限的增長而下降，3齡和4齡老芒麥根際土壤浸提液處理下顯著高于5齡和8齡(P<0.05)。

圖1 不同種植年限老芒麥根際土壤脂肪酸酯類物質GC-MS色譜圖Fig.1 GC-MS map of fatty acid lipids in soil of rhizosphere soil of Elymus sibiricus L.in different planting years

表1 不同種植年限老芒麥根際土壤中脂肪酸酯類物質的相對含量Table 1 Relative contents of fatty acids and lipids in rhizosphere soil of Elymus sibiricus L. in different planting years

圖2 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對其種子發芽率的影響Fig. 2 Effects of soil extracts on seed germination rate of Elymus sibiricus L. in different planting years注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments at the 0.05 level,the same as below

2.2.2不同年限土壤浸提液對老芒麥種子發芽勢的影響 由圖3可知，3齡老芒麥根際土壤浸提液在50 g·L-1濃度下發芽勢較高，為49%，5齡老芒麥根際土壤浸提液在500 g·L-1的濃度處理下發芽勢較低，值為30%。在5齡和8齡根際土壤浸提液處理下，老芒麥種子發芽勢會隨著土壤浸提液濃度的升高而呈下降趨勢，且5齡老芒麥根際土壤在200 g·L-1和500 g·L-1處理下種子發芽勢顯著低于同齡50 g·L-1浸提液處理，分別降低了32%和37%(P<0.05)。土壤浸提液濃度為50 g·L-1時，3齡老芒麥根際土壤浸提液處理下種子發芽勢較8齡提高了29%(P<0.05)；在200 g·L-1濃度下，老芒麥種子的發芽勢隨年限增長呈現出先降低后升高的規律，在5齡時最低，較3和4齡分別降低了26%和24%(P<0.05)。

圖3 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對其種子發芽勢的影響Fig.3 Effects of soil extracts on seed germination potential of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.2.3不同年限土壤浸提液對老芒麥胚芽長的影響 由圖4可知，不同濃度與不同年限的土壤浸提液會影響老芒麥胚芽生長。4齡老芒麥根際土壤浸提液在100 g·L-1的濃度處理下老芒麥胚芽較長，達到5.6 cm，胚芽長在50 g·L-1的8齡老芒麥根際土壤浸提液處理下較短，為4.5 cm；3齡老芒麥根際土壤浸提液處理中，胚芽長隨濃度升高先下降后升高，200 g·L-1濃度處理下較50，100和500 g·L-1處理分別降低了21%，15%和10%；在4齡老芒麥根際土壤浸提液處理中，胚芽長隨濃度升高先升高后降低，500 g·L-1濃度處理較100 g·L-1濃度處理下降低了16%(P<0.05)。在浸提液濃度為200 g·L-1的處理下，老芒麥胚芽長度會隨著年限增長而增長，3齡根際土壤浸提液處理顯著低于4，5和8齡，而在500 g·L-1濃度處理下，隨著年限的增長，胚芽長度降低。

圖4 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對其幼苗胚芽長的影響Fig.4 Effects of soil extracts on germ length of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.2.4不同年限土壤浸提液對老芒麥胚根長的影響 由圖5可知，3齡老芒麥根際土壤浸提液處理下，老芒麥幼苗胚根長會隨著濃度的升高而下降，胚根長在500 g·L-1濃度處理下較其他3個濃度分別降低了28%，21%和17%(P<0.05)；8齡老芒麥根際土壤浸提液處理下，幼苗胚根長同樣隨著濃度升高而降低，濃度為500 g·L-1處理時，老芒麥胚根長較短，為2.7 cm，較50 g·L-1和100 g·L-1的濃度處理分別降低了25%和20%(P<0.05)。在浸提液濃度為100 g·L-1的處理下，老芒麥幼苗胚根長會隨著年限的增長先降低后升高，在5齡根際土壤浸提液處理下較低，當浸提液濃度為200 g·L-1時，胚根長會隨著年限增長而下降。

圖5 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對其幼苗胚根長的影響Fig.5 Effects of soil extracts on radicle length of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.3 浸提液不同年限、濃度及其互作對種子萌發及幼苗生長影響的方差分析

表2雙因素方差分析結果顯示，年限與浸提液濃度對老芒麥種子的發芽率、發芽勢、胚芽長和胚根長會產生顯著或極顯著影響，年限對種子發芽勢與胚根長的影響不顯著，對發芽率影響極顯著(P<0.01)，對胚芽長影響顯著(P<0.05)。而浸提液濃度對種子萌發與幼苗生長均存在極顯著影響(P<0.01)，而浸提液年限與濃度的交互作用對發芽率、發芽勢和胚芽長影響極顯著(P<0.01)，對胚根長無顯著影響。

表2 年限、濃度及其互作對種子萌發及幼苗生長影響的方差分析Table 2 Results of two-way ANONA of characteristics by years,concentrations and their interactions on seed germination and seedling growth

3 討論

3.1 不同種植年限老芒麥根際土壤脂肪酸酯類物質含量變化

脂肪酸是根系分泌物的主要物質之一[19-20]，在許多植物中存在著多種脂肪酸類物質，并且植物連作年限會影響其物質的分泌和積累[21]，進而影響連作種植下自毒程度的強弱。鄭陽霞等[22]研究表明，脂肪酸酯類物質會破壞西瓜幼苗的抗氧化系統，抑制幼苗的生長。本研究表明，種植老芒麥年限不同，其根際土壤中脂肪酸酯類物質含量存在差異，且棕櫚酸甲酯、十七烷酸甲酯和硬脂酸甲酯含量隨年限的升高呈現先升高后下降的規律，均在5齡時最高，這可能是老芒麥經過5年的種植后，植株內部生理代謝系統發生了改變，導致不同年限老芒麥分泌的化感物質含量具有差異，導致在第8年生長時，根系分泌的物質組分與含量發生變化；本研究結果還表明，5齡根際土壤中脂肪酸酯類物質的總含量是最高的，而在種植了8年的根際土壤中脂肪酸酯類物質總含量有所下降，說明老芒麥在多年的建植過程中，可能隨著年限的增長，土壤中脂肪酸酯類物質的積累會達到一個峰值，從而影響老芒麥生長發育，使其根系分泌物減少，并結合土壤自身的緩沖性[23]，使第8年時土壤中脂肪酸酯類物質含量較低。有研究發現，當自毒物質的積累超過某個閾值，便會產生自毒效應使植株生長受阻，導致根系分泌物的種類和數量相對減少[24-25]，這與本試驗結果相一致。

3.2 不同種植年限老芒麥根際土壤浸提液對其種子萌發及幼苗生長的影響

種子萌發期是植物生長的首要階段，萌發期會對外界環境產生最敏感的響應，而且種子萌發會影響植株的出苗率和種群數量，幼苗則會直接影響植株的產量和品質[26]。楊倩等[27]在異齡苜蓿土壤浸提液對3種植物種子萌發的影響的研究中發現，5齡苜蓿根際土壤浸提液對其種子萌發的抑制作用強于3齡和9齡土壤；王英等[28]研究表明，不同濃度伊貝母根際土壤浸提液對其種子萌發存在濃度效應。本試驗結果表明，老芒麥種子萌發在不同年限和不同濃度老芒麥根際土壤浸提液下表現存在差異。在不同年限下，低濃度的根際土壤浸提液對老芒麥種子萌發、胚芽長和胚根長產生的抑制效果不明顯，表明了自毒物質可能要積累到一定的濃度水平才會產生抑制作用，這與胡躍高等[29]在苜蓿的自毒性研究中得到的結果相似。在5齡和8齡的根際土壤浸提液處理下，隨著浸提液濃度升高，發芽勢、發芽率和胚根長抑制作用逐漸增強，而胚芽長沒有呈現這一趨勢，一方面說明老芒麥不同部位對自毒物質響應有差異，另一方面也說明了老芒麥種植年限與浸提液濃度都是影響老芒麥種子發芽和幼苗生長的因素，這與張新慧等[30]在當歸(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)根際土壤水浸液的自毒作用研究及化感物質的鑒定試驗中的研究結果相一致。在本試驗中，浸提液濃度為200 g·L-1和500 g·L-1時，5齡根際土壤浸提液對種子發芽抑制作用最強，而8齡時抑制作用又有所減弱，這可能是因為老芒麥在種植2～4年期間植株生命力最旺盛，分泌的根系分泌物較多，在第5年時自毒效應反饋到老芒麥生長發育時期，導致根的發育受到抑制，根系分泌物從源頭上減少，到第8年時根系分泌物被土壤自我調節或者對周圍雜草產生化感效應而吸收，從而種植老芒麥8年的土壤浸提液對種子發芽的抑制作用低于5年土壤。王希[31]在黃土高原紫花苜蓿自毒效應的初步研究中同樣發現，種植紫花苜蓿5年的土壤浸提液處理其種子，發芽率低于種植紫花苜蓿9年的土壤浸提液處理，這與本試驗結果相一致。

從雙因素方差分析可知，年限、濃度和年限與濃度的交互作用都會影響種子萌發和幼苗生長，表明老芒麥隨著種植年限的增長，自毒物質在土壤中滯留、轉化，在積累到一定濃度后，會制約老芒麥生長發育，導致老芒麥人工草地補播效果不明顯。李玉占等[32]研究表明，苜蓿在5年后生產力下降，在間隔時間短的情況下，補播很難成功，其自毒效應可能是主要原因之一，這與本試驗結果相一致。

綜上，不同種植年限老芒麥土壤浸提液存在自毒作用，在5齡時表現突出。因此，可以推斷老芒麥很可能存在連作障礙，并且自毒作用是連作障礙的主要原因之一，而自毒物質除了脂肪酸酯類物質，可能還存在成百上千種，這有待于更進一步研究。

4 結論

本研究表明，5齡老芒麥根際土壤中脂肪酸酯類物質的相對總含量較高，為50%；5和8齡老芒麥根際土壤浸提液對其種子發芽率具有明顯的“低促高抑”濃度效應；在浸提液濃度為200 g·L-1時，年限增長與胚根長生長呈負相關；年限對種子發芽率影響極顯著，對胚芽長影響較顯著。因此推測，老芒麥逐漸衰退與自毒作用導致的連作障礙有密切的關系，怎樣減弱自毒物質的毒害進而延緩老芒麥退化需要進一步研究。