黑暗處理對百里香揮發性物質日變化的影響

司家屹，王祎琛，毛俊儼，楊秀云

(山西農業大學林學院，功能油料樹種培育與利用山西省重點實驗室，山西 太谷 030801)

植物揮發性物質是植物次生代謝產生的具有揮發性的小分子有機化合物[1]，具有重要的觀賞、經濟和醫藥價值[2-4]，對于植物自身抵御逆境、促進繁殖、適應環境也具有重要意義[5-7]。由于植物自身狀態以及外界環境條件的改變，植物揮發物的合成與釋放是動態變化的，并呈現一定的節律[8]。研究表明植物揮發物的合成與釋放存在以24小時為周期的日變化，即晝夜節律。例如山桃草(GauralindheimeriEngelm. et Gray)在白天揮發物釋放量大[9]，而東方百合‘西伯利亞’(Lilium‘Siberia’)釋放的萜烯類化合物在一天當中呈先升高后降低的趨勢[10]。光照是使植物體內生物鐘與晝夜變化同步的一種授時因子，也是影響植物代謝的重要因素[11]。正常光照下植物會通過生物鐘核心調控元件對環境中光照信號進行整合，協調代謝活動[12]。給予植物黑暗處理時，光照因子劇烈變化，植物代謝也變化劇烈。研究黑暗處理下與正常光照下揮發性物質的日變化規律，對于揭示黑暗對揮發性物質釋放的影響具有重要意義。

百里香(Thymusmongolicus)是唇形科百里香屬植物，不僅具有觀賞價值，還具有很高的經濟與生態價值，可用于食用、藥用、畜牧、蜜源、園林觀賞、防風固沙等方面[13-14]。并且百里香全株具有香氣，也是一種具有開發價值的芳香植物。本試驗將長勢一致、無病蟲害的當年生百里香分別置于黑暗處理和正常光照中，使用氣質聯用法(HS-SPME/GC-MS)對其釋放的揮發性物質進行采集，探究黑暗處理對百里香揮發物釋放日變化節律的影響，為探明植物揮發物釋放機理提供一定理論基礎，同時為百里香的有效開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

百里香種源來源于山西省渾源縣自然生長的群落(經度113 °72 ′66.97 ″，緯度39 °63 ′77.52 ″，海拔1 363.45 m，無霜期140 d，年均氣溫6.2℃，年降水量388.0 mm，年日照時數2 627.0 h)，2015年引種到山西農業大學苗圃種植。2019年5月12日選擇長勢一致的當年生百里香枝條進行扦插繁殖，將其均栽植于7 cm×7 cm的花盆中，栽培基質為混合土壤(混合土壤的體積比為原土∶砂土∶腐殖質=2∶1∶1)。管理過程中的水、肥及光照條件保持一致，2019年9月12日選取枝葉繁茂、無病蟲害、長勢一致的百里香扦插苗進行試驗處理。

1.2 試驗方法

試驗設置2個處理，每個處理重復3次。對照組為置于正常光照環境下的百里香，試驗組于試驗當天早晨6:00采用PVC黑色遮蔭網進行處理，遮蔭棚南北向放置，便于通風透氣，東西向遮蔭網設于距地面150 cm處。(試驗各時段采用TES-1334A照度計測定光照，均為0 lux)花盆之間保持30 cm以上的距離，避免植株冠層間受光干擾影響。采用多株混合取樣法，每隔4小時(取樣時間為0:00；4:00；8:00；12:00；16:00；20:00)采集長勢一致、位置相同的百里香健康葉片。將采集葉片用蒸餾水沖洗干凈，并用濾紙擦干，混勻后精確稱取0.50 g放置于5 mL萃取瓶中密封。

揮發物質測定方法采用氣相色譜質譜聯用(HS-SPME/GC-MS)技術[15]。GC(Gas Chromatography，trace 1300型號，Thermo Fisher公司生產)條件設計為色譜柱為HP-5MS石英毛細管柱，起始溫度為40℃，停留3 min，以5℃·min-1升溫270℃，停留6 min。進樣口溫度為270℃，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL·min-1，不分流進樣。萃取頭為DVB/CAR/PDMS，50℃震蕩15 min，吸附5 min，進樣口270℃解吸附5 min。MS(Mass Spectrometry，trace ISQ型號，Thermo Fisher公司生產)質譜的離子源為EI源，離子傳輸線250℃，離子源溫度為230℃，質量掃描范圍50～550 amu。

1.3 數據分析

使用計算機質譜數據庫NBS對采集到的質譜圖進行檢索，采取峰面積歸一化法計算檢測出的化學物質的相對含量(將樣品中所有能檢測出峰的化合物的峰面積之和視作1，每個組分的峰面積與總峰面積的百分比代表其相對含量)[16]。使用Excel 2013進行數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 黑暗處理對揮發物種類日變化的影響

正常光照下的百里香在6個采樣時間內共檢測出80種揮發性物質，而黑暗處理下檢測出揮發物質77種。主要包括烯烴類、芳香烴類、醇類、酚類和酯類5大類。其中烯烴類揮發物種類數明顯高于其余類別的化合物。黑暗處理對百里香釋放的揮發物質種類波動趨勢有明顯的影響，正常光照下揮發物種類出現兩個低谷(12∶00和0∶00)，種類數分別為36種和33種，揮發物種類峰值出現在8∶00，檢測出50種揮發物，其余3個時段均檢測出41種揮發物。黑暗處理下揮發物種類的波動趨于平緩，夜間釋放種類數量基本相等(20∶00，0∶00，4∶00分別為38種、36種和37種)，早8∶00釋放種類30種，12∶00和16∶00分別釋放種類26種和25種。

不同類型揮發物對黑暗處理的響應不同。正常光照和黑暗處理下烯烴類揮發物的日變化均呈波動趨勢，但正常光照下的波動較大，范圍為15～27種，黑暗處理下的波動較小，范圍為12～17種。芳香烴類正常光照下數量在5～7種范圍內波動，黑暗處理下8∶00釋放最多為9種，其余時間為4～5種。黑暗處理對醇類化合物數量日變化趨勢也有影響，正常光照下最大值出現在8∶00(9種)，最小值出現在12∶00(5種)，黑暗處理下的醇類揮發物數量在白天少(8∶00-16∶00為1～3種)，在夜晚多(20∶00-4∶00為6～8種)。正常光照下酚類揮發物數量最大值出現在16∶00(為3種)，0∶00揮發物數量最少(1種)，黑暗處理下12∶00、16∶00未釋放酚類揮發物，其余時間均釋放了1種。酯類揮發物數量在正常光照下8∶00-12∶00上升(2～4種)，之后變化較為和緩(1～2種)，在黑暗處理組中8∶00-16∶00上升(0～4種)，16∶00-0∶00下降(4～2種)。

圖1 正常光照及黑暗處理兩種處理對揮發物種類日變化的影響Fig.1 Effects of normal and dark treatments on diurnal variation of volatile species

2.2 黑暗處理對不同揮發物相對含量日變化的影響

2.2.1黑暗處理對烯烴類揮發物相對含量日變化的影響 研究表明(表1)，烯烴類物質是百里香揮發性物質的主要種類，黑暗處理對于烯烴類揮發物的日變化趨勢及幅度均有影響。黑暗處理組的烯烴類揮發物相對含量變化范圍為38.24%～51.47%，正常光照組的為44.08%～49.58%，黑暗處理組的變化范圍是正常光照組的41.57%。正常光照下烯烴類揮發物相對含量在20∶00時出現低谷(38.24%)，其余時段相對含量變化平緩(48.50%～51.50%)。黑暗處理下4∶00和8∶00烯烴類化合物相對含量出現高峰(分別為48.01%和49.58%)，其余時段釋放較少(44.08%～46.72%)。

有7種烯烴類物質是所有樣本共有的，黑暗處理對不同物質相對含量日變化有不同影響。正常光照下的r-萜品烯相對含量呈升高-降低-升高-降低的趨勢，黑暗處理下的僅在12∶00-20∶00時變化趨勢與正常的相反，其余時間相同。正常光照下和黑暗處理下水芹烯相對含量日變化均較小。4-甲基-1-異丙基二環[3.1.0]己-2-烯相對含量在正常光照下呈下降-上升-下降趨勢，8∶00出現高峰(4.38%)，黑暗處理下出現高峰的時間提前到4∶00(4.03%)，其余時間較為和緩(3.01%～3.41%)。光照下8∶00,12∶00檜烯的相對含量較高(0.97%～1.67%)，黑暗處理下4∶00的相對含量最高(1.07%)，其余時間正常光照和黑暗處理下的檜烯相對含量變化均較小(0.62%～0.74%)。正常光照下莰烯相對含量在8∶00-20∶00從3.11%下降至0.09%，到0∶00和4∶00有所升高(2.57%和2.25%)，黑暗處理的則在1.01%～2.05%范圍內不斷波動。大牛兒烯D在正常光照下的變化趨勢與r-萜品烯的一致，但在黑暗處理下呈先下降再上升趨勢，且變化幅度更小。正常光照下Δ-杜松烯在12∶00與20∶00釋放較少，僅為0.40%，16∶00釋放較多，為2.25%，黑暗處理的僅8∶00釋放較多(1.06%)。

表1 百里香葉片中烯烴類揮發物相對含量日變化Table 1 Diurnal variation of relative content of olefin volatiles in Thymus mongolicus leaves

續表1

Note∶"-" means the presence of this volatile substance is not detected in this sample,the same as below

2.2.2黑暗處理對芳香烴類揮發物相對含量日變化的影響 黑暗處理下的芳香烴類揮發物相對含量均大于正常光照下的，并且黑暗處理對其日變化有影響。黑暗處理組的芳香烴類揮發物相對含量變化范圍為20.17%～26.38%，正常光照組的為28.50%～32.29%，黑暗處理組的變化范圍是正常光照組的61.03%。0∶00時正常光照下的芳香烴類揮發物相對含量較高(26.38%)，其余時間較為和緩(20.17%～23.65%)。黑暗處理中的則在8∶00-20∶00釋放較多(30.72%～32.29%)，0∶00，4∶00釋放較少(28.50%，29.06%)。

檢測出的11種芳香烴類揮發物中，鄰-異丙基苯和2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯是所有檢測樣本中共有的。正常光照與黑暗處理下，鄰-異丙基苯最小值均出現在8∶00(正常光照下為15.61%，黑暗處理下為23.52%)，正常光照下最大值出現在0∶00(22.59%)，黑暗處理下最大值出現在16∶00(29.67%)。正常光照下2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯日變化在4∶00時出現高峰(6.07%)，其余時段相對含量變化平緩(2.50%～4.08%)，而黑暗處理下的則在1.69%～2.72%區間內波動。

表2 百里香葉片中芳香烴類揮發物相對含量日變化Table 2 Diurnal variation of relative content of aromatic hydrocarbon volatiles in Thymus mongolicus leaves

續表2

2.2.3黑暗處理對醇類揮發物相對含量日變化的影響 黑暗處理導致醇類揮發物相對含量日變化波動幅度減小，黑暗處理組的醇類揮發物相對含量變化范圍為4.71%～14.18%，正常光照組的為5.39%～9.45%，黑暗處理組的變化范圍是正常光照組的42.87%。正常光照下的醇類揮發物相對含量呈下降-上升-下降-上升的波動趨勢，相對含量最大值為20∶00的14.18%，最低值為0∶00的4.71%。所有時段，黑暗處理的日變化趨勢與正常光照的均相反，但變化幅度較小(5.39%～9.45%)。

在不同時間所有樣本中均有檢測到桉葉油醇。一天中正常光照下桉葉油醇相對含量的呈下降-上升-下降趨勢，20∶00相對含量最高(11.58%)，0∶00相對含量最低(4.21%)，黑暗處理下的則在5.39%～9.45%間波動。

表3 百里香葉片中醇類揮發物相對含量日變化Table 3 Diurnal variation of relative content of alcohols volatiles in Thymus mongolicus leaves

續表3

2.2.4黑暗處理對酚類揮發物相對含量日變化的影響 正常光照下，8∶00-16∶00酚類相對含量變化幅度較小(1.00%～1.88%)，20∶00，4∶00釋放較多(3.48%，4.52%)，0∶00酚類相對含量最低(0.01%)。黑暗處理下酚類揮發物相對含量日變化較小，各時段的均小于1.00%，且12∶00和16∶00時未在樣本中檢測到酚類揮發物。

正常光照下百里酚相對含量在4∶00，8∶00釋放較多(1.40%，0.79%)，其余時間釋放較少(0.00%～0.26%)，黑暗處理組中則未檢測到其存在。香芹酚在正常光照組的所有樣本中均有釋放，日變化趨勢與酚類揮發物的相同，黑暗處理組的僅在20∶00與4∶00釋放。

表4 百里香葉片中酚類揮發物相對含量日變化Table 4 Diurnal variation of relative content of phenols volatiles in Thymus mongolicus leaves

2.2.5黑暗處理對酯類揮發物相對含量日變化的影響 正常光照下和黑暗處理下的百里香葉片中檢測出的酯類揮發物相對含量均較少，日變化幅度也均不明顯在0.00%～0.44%范圍內波動。同時段正常光照的和黑暗處理的酯類揮發物相對含量存在差異。

正常光照下的百里香在6個檢測時間中均釋放了乙酸乙酯，12∶00相對含量最大，為0.27%，其余時間釋放均較少，在0.02%～0.09%范圍內變化。黑暗處理對乙酸乙酯日變化具有影響，黑暗處理的乙酸乙酯相對含量日變化呈先上升后下降趨勢，在16∶00最大(0.07%)，4∶00與8∶00未檢測出乙酸乙酯。

表5 正常光照下百里香葉片中酯類揮發物相對含量日變化Table 5 Diurnal variation of relative content of esters volatiles in Thymus mongolicus leaves

2.2.6黑暗處理對其它揮發物相對含量日變化的影響 其它揮發物都為相對含量較低、同類化合物較少的揮發物，無明顯日變化趨勢。其中，黑暗處理組中均有釋放(3E2E)-2-亞乙基-6-甲基-3,5-二烯醛，20∶00含量最高(0.18%)，其余時間變化平穩(0.01%～0.08%)，正常光照的僅在12∶00和0∶00檢出，相對含量分別為0.08%和0.24%。其他揮發物僅在極少的樣本中被檢測到，相對含量也較低。

表6 百里香葉片中其它揮發物相對含量日變化Table 6 Diurnal variation of relative content of other volatiles in Thymus mongolicus leaves

續表6

3 討論

黑暗環境會影響影響各類揮發物的釋放，但由于植物體內次生代謝途徑多樣，各類揮發物受黑暗影響的機理也不同[17-18]。植物次生代謝會產生多種萜類化合物，目前已發現近40 000種[19-20]，本研究中百里香釋放的大部分烯烴類物質及芳樟醇、萜烯醇、桉葉油醇等部分烯烴含氧衍生物均為萜類化合物，釋放的總的相對含量與總種數均較多，與劉敏等人對黑黃檀(DalbergiafuscaPierre)、降香黃檀(DalbergiaodoriferaT. Chen)的研究結果一致[21]。光照是植物進行生命活動的重要生態因子，萜類化合物的合成對光照也十分敏感[22]。本研究中，黑暗處理下百里香釋放的烯烴類化合物的相對含量與種類數均小于正常光照，一方面是由于光照是影響光合作用的重要因子，光合作用是植物體內主要的供能反應，同時其產物也是許多次生代謝的前體物質，從能量與物質兩方面都干擾著烯烴類化合物的合成[23-24]；另一方面光照會提高萜類相關合成酶基因的表達量，Kawoosa等人[25]對胡黃連研究發現光照下與萜類合成有關的pkhmgr和pkdxs酶表達量更高，使前體物質分配至萜類代謝途徑更多。

芳香烴類揮發物是草莽酸代謝途徑的重要產物。苯丙氨酸是草莽酸代謝途徑的重要前體物質，在黑暗環境下會不斷積累[26]，黑暗處理下百里香芳香烴類揮發物相對含量較光照的更高，變化幅度也較光照的更小。酚類物質在植物體內主要通過苯丙烷代謝途徑產生，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸-CoA聯結酶是此途徑的3個關鍵酶[27]。

光照會誘導苯丙烷代謝途徑中苯丙氨酸解氨酶活性增強[28]，產生酚類物質，本研究中黑暗處理下的中百里香缺少光照的誘導，因而釋放的酚類物質相對含量較低。此外，黑暗環境下無紫外線也是酚類化合物釋放較少的重要原因，自然光中含有的紫外光會對植物細胞造成紫外線損傷，植物通過合成酚類化合物使到達細胞的紫外線減少從而減少損傷，已有研究發現山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)和桃(AmygdaluspersicaL.)在紫外線照射后酚類化合物含量增加[29-30]。

植物釋放總揮發物是次生代謝產生的各種揮發物的集合，其合成與釋放具有日變化規律，但不同植物日變化趨勢不同[31-32]。一天中百合(Liliumbrowniivar.viridulum)[10]、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)[33]等植物釋放的揮發物數量呈先增加后降低的趨勢，毛竹(Phyllostachysheterocycla(Carr.) Mitford ‘Pubescens’)[34]揮發物數量日變化趨勢則表現為上升-下降-上升-下降。本研究發現，正常光照下百里香揮發物數量呈下降-上升-下降-上升趨勢，低谷期為12∶00和0∶00，高峰期為8∶00。植物生物鐘核心調控網絡可以分為中心循環、早晨循環和傍晚循環[35]，本研究中黑暗處理下百里香在各時段揮發物數量均減少，且白天(8∶00，12∶00和16∶00)與夜間相比影響大，這可能是由于調控百里香揮發物釋放的早晨循環受光照影響大，黑暗處理阻礙部分揮發物代謝，導致白天黑暗處理的比正常光照的揮發物數量減少，而傍晚循環受光照影響小，導致黑暗處理的與正常光照的揮發物數量相近。

4 結論

正常光照和黑暗環境下，百里香釋放的揮發性物質主要為烯烴類、芳香烴類、醇類、酚類和酯類5大類，其中烯烴類揮發物數量與相對含量均明顯高于其余類別的化合物。黑暗環境對于百里香揮發物數量日變化具有影響，減少了揮發物總數量，并且最大值與最小值出現時間發生改變。黑暗處理同樣使各類揮發物相對含量最大值最小值出現時間改變，并且減小了揮發物相對含量日變化波動幅度。可見黑暗處理會對百里香揮發性物質的合成與釋放產生影響。