一起賽鴿煙曲霉菌病的診斷

薛 聰，范 穎，張文鑫，孟 斌，郭繁霞，孫培明*

（1.臨沂大學農林科學學院，山東 臨沂 276000；2.臨沂科技職業學院，山東 臨沂）

為了鑒定門診遇到的一起以呼吸困難為主要臨診癥狀，以肺臟、氣囊、腹膜等組織器官灰白色粟粒狀結節為主要病變的賽鴿是否感染了霉菌，采集病死鴿組織樣本進行霉菌的分離培養、菌落形態觀察和染色鏡檢試驗，從賽鴿組織樣本中分離鑒定到一株煙曲霉菌。煙曲霉菌在高鹽察氏瓊脂培養基上呈現煙綠色絨毛狀、棉絮樣絲狀菌落。光鏡觀察可見散在分布的霉菌菌體，每個菌體由分生孢子梗、分生孢子頭組成；分生孢子梗光滑，呈微綠色；分生孢子頭又包含燒瓶狀頂囊、單層輻射狀小梗和綠色的球形分生孢子。

鴿曲霉菌病又稱鴿曲霉菌性肺炎，是一種真菌性傳染病。曲霉菌病主要是由煙曲霉菌和黃曲霉菌這兩種病原體引起[1]。鴿曲霉菌性肺炎主要侵犯鴿的呼吸器官導致呼吸障礙，偶爾也侵害眼、肝及腦等組織，典型病變為肺部有黃白色或灰白色的霉菌結節。一般可通過肺部的典型剖檢變化對鴿曲霉菌病做初步診斷。但為了確診和明確具體病原仍需進行曲霉菌的分離鑒定。

1 材料

1.1 樣本

山東省某賽鴿養殖場飼養賽鴿約3 000 羽，2020 年6 月鴿群陸續發病，主要以2 月齡的青年鴿為主，發病率約為5 %。病鴿初期表現為精神沉郁、食欲不振、反應遲鈍、羽毛蓬亂。隨著病程發展，病鴿表現出呼吸困難、張口呼吸有“呼呼”的喘息聲。部分病鴿出現下痢，排黃白色或綠色稀便。少數賽鴿眼睛一側或兩側灰白色渾濁，流漿液性淚液，下眼瞼有干酪樣凝塊。有的病鴿出現頭頸扭曲、共濟失調等神經癥狀。嚴重的病鴿迅速消瘦，繼而死亡。發病期間使用了恩諾沙星等抗菌藥物，但效果較差，發病數量呈上升趨勢。之后使用制霉菌素等抗霉菌藥物，配合使用抗菌藥物，病情逐步得到控制。

1.2 主要試劑 高鹽察氏瓊脂培養基（批號HB0234）、營養瓊脂培養基（批號HB0109）、營養肉湯培養基（批號HB0108）均購自青島高科園海博生物技術有限公司。苯酚、乳酸、甘油等化學試劑均為國產分析純產品。

1.3 主要儀器 恒溫培養箱（型號為 DHP-9082B），購自上海一恒科學儀器有限公司；超凈工作臺（型號為SW-CJ-2D），購自江蘇蘇凈集團有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（型號為YXQ-LS-100A），購自上海博訊實業有限公司；顯微鏡（型號為CX33），購自奧林巴斯有限公司；載玻片、蓋玻片均購自江蘇世泰實驗器材公司。

2 方法

2.1 病理檢查 剖檢病死賽鴿共10 羽，對各組織器官的病理變化進行觀察、記錄并拍照。無菌采集肺臟、肝臟、霉菌結節用于后續分離培養。

2.2 霉菌的分離培養 按常規方法取組織樣本在制備好的高鹽察氏培養基上進行劃線分離培養。隨后將培養皿倒置在恒溫箱里培養，溫度設置為28 °C。觀察并記錄霉菌菌落形態、顏色、質地等。挑取霉菌菌絲接種于新的高鹽察氏瓊脂培養基中進行純培養。

2.3 霉菌的染色鏡檢 待霉菌菌落的生長形態穩定時，用接種環無菌挑取菌落中心或邊緣部位少量菌絲，置于滴有乳酸苯酚溶液的載玻片上并混勻，加蓋玻片后在顯微鏡下觀察并記錄霉菌顯微觀察結果。

2.4 細菌的分離培養 無菌采集病死鴿的肺臟、肝臟組織，常規方法劃線接種于營養瓊脂培養基和營養肉湯瓊脂培養基，置于37 ℃ 恒溫箱培養24 h，觀察細菌生長情況。

3 結果與分析

3.1 病理變化 對病死鴿進行剖檢，主要病理變化為肺臟表面和內部有灰白色、黃白色的霉菌結節，有的結節相互融合成大的團塊。肺組織質地較硬、彈性消失，切開時內容物呈現干酪樣、輪層狀結構。另外在氣囊、腹膜、腸道漿膜等組織器官同樣可見針尖至米粒或豆粒大小的霉菌結節。

3.2 霉菌的分離培養 （1）高鹽察氏培養基上培養48 h，肉眼觀察可見針尖大小的白色絨毛樣菌落。培養72 h，菌落形態特征較為明顯，肉眼能明顯觀察到絨毛狀、棉絮樣絲狀菌落，表面呈煙綠色、粉末狀。培養96 h，觀察到菌落面積變大，邊緣均勻、平滑，質地呈絲絨狀或發絮狀的暗綠色菌落，菌落反面呈黃綠色，初步判定為煙曲霉菌。（2）在潔凈載玻片上滴加一滴乳酸苯酚溶液，挑取少量菌絲并與之混勻，置100 倍光學顯微鏡下觀察可見散在分布的霉菌菌體，每個菌體由分生孢子梗和分生孢子頭組成。進一步通過400 倍鏡檢觀察，分生孢子梗光滑，呈微綠色。在分生孢子梗莖的頂端具有膨大的分生孢子頭，分生孢子頭包含狀如燒瓶的綠色頂囊、單層輻射狀小梗和球形分生孢子，頂囊與分生孢梗莖存在一定角度。分生孢子同樣為綠色，呈圓形或卵圓形。

3.3 細菌的分離培養 37 ℃ 恒溫箱培養24 h，肺臟、肝臟組織劃線接種的營養瓊脂培養基、營養肉湯瓊脂培養基，均未觀察到細菌菌落生長。

4 討論

4.1 鴿曲霉菌病的流行現狀 （1）禽曲霉菌病是雞、鴨、鵝、鴿子等的一種真菌性疾病，主要特征為霉菌性肺炎，往往呈急性群發性暴發，發病率、死亡率較高[2]。本病主要發生于幼禽，成年禽具有一定抵抗力，近年來中禽與成禽發病有增加的趨勢。2018 年6 月，新疆某雞場的30 日齡麻花雞發生霉菌性肺炎，病雞張口呼吸并有呼吸“哨音”，剖檢可見肺臟有灰白色粟粒狀結節病變，支氣管有黃白色干酪樣物質堵塞[3]。2014 年3 月，山東省臨沂市某養殖場的15 日齡肉鴨發生以呼吸道癥狀為主要特征的煙曲霉菌病[4]，發病率超過50 %，死亡率約為15 %，剖檢可見肺臟和氣囊有黃白色或灰白色結節。2019 年6 月，河北省某賽鴿養殖場發生曲霉菌病，以3 月齡的青年鴿為主，主要表現為氣喘等呼吸道癥狀，氣囊、肺臟可見霉菌結節[5]。本文報道的賽鴿病例都同樣主要表現為呼吸道癥狀，另外有少數病鴿出現頭頸扭曲、共濟失調等神經癥狀。（2）霉菌感染不僅會在感染部位造成局部損傷，還會通過產生毒力較強的霉菌毒素繼而造成多組織器官損傷。煙曲霉是曲霉菌屬致病性最強的霉菌，除了直接損傷和毒素危害，還能導致感染禽免疫抑制、免疫器官萎縮、免疫機能下降，這不僅影響疫苗免疫效果，也容易繼發感染大腸桿菌等病原微生物[6]。尤其是賽鴿，一旦發生曲霉菌病，即使經過治療恢復健康，也常常會因為比賽成績不佳而被淘汰，從而造成巨大的經濟損失。

4.2 鴿曲霉菌病的診斷與治療 （1）在生產實踐中，通常根據肺臟、氣囊等臟器的剖檢變化即可診斷為禽曲霉菌病。但由于禽曲霉菌病實質上是一類病，其病原又分為多種曲霉菌，為了確診和分析病因仍需進行曲霉菌的分離培養與鑒定。臨床上引起禽霉菌病的主要病原體為煙曲霉菌，黃曲霉菌較少見，偶爾也可從病料中分離出青霉菌、土霉菌、木霉菌、毛霉菌、米根霉菌等[7]。蘇戰強等人于2018 年從新疆雞場的霉菌性肺炎樣本內分離到煙曲霉、黃曲霉、米根霉，并且煙曲霉的菌落數量明顯多于黃曲霉和米根霉[3]。而在本研究中，從賽鴿中同樣分離、鑒定到煙曲霉菌，通過菌落形態、鏡檢觀察，結合臨床癥狀和病理變化，最終確診為賽鴿煙曲霉菌病。（2）煙曲霉菌廣泛分布于自然界，產生孢子的能力強，常存在于霉變飼料、禽舍地面、用具和環境中。Sehar 等研究表明：鴿子密集區的土壤和空氣中含有煙曲霉等真菌的孢子[8]。Julman 等對鴿子飼養場中的土壤進行真菌篩查，結果從含有大量鴿子排泄物的土壤中分離得到了多種致病真菌，其中煙曲霉菌所占比例最高，占比為31.1 %[9]。防控本病首先應禁止飼喂發霉變質的飼料，杜絕病從口入。其次，搞好環境衛生和消毒工作。徹底清理鴿舍，用火堿、過氧乙酸等消毒劑對地面和墻面進行消毒，并保持飼養場、飼料倉庫的干燥衛生。另外，注意合理的鴿群飼養密度，避免應激。在免疫接種、驅蟲、訓飛以及比賽時，在飼料中適當增加維生素、微量元素以提高賽鴿自身的抵抗力。（3）病死鴿及時進行淘汰和無害化處理，癥狀較輕者應盡快使用制霉菌素、碘化鉀、硫酸銅等抗霉菌藥物。配合使用抗生素防止繼發感染，同時在飲水中添加葡萄糖、電解多維等營養藥增強抵抗力，一般會取得較好的效果。另外，值得注意的是煙曲霉也可以感染哺乳動物和人。2019 年，于寧等報道了一例飼鴿者侵襲性肺曲霉菌感染的病例[10]。2020 年陳肖等報道了一例流感病毒性肺炎合并煙曲霉感染病例[11]，提示飼鴿者與煙曲霉菌感染的關聯性，以及煙曲霉對人的危害，應該引起足夠重視。