兩種檢測方法在牛結核病檢疫的應用

陳建豪 段進剛 阿不都熱依木·賽提 張志新 玉努斯·阿不都 馬春江

（新疆哈密市動物疫病預防控制中心 839000)

1 材料與方法

1.1 儀器和設備

電子游標卡尺、電動剃毛器、肝素抗凝管、酶標儀、恒溫培養箱、離心機、微量移液器等；國產牛型提純結核菌素（PPD）購自哈藥集團生物疫苗有限公司；BOVIGAMTM 牛結核分枝桿菌γ-干擾素檢測試劑盒購自prionics 公司。

1.2 試驗動物

試驗動物來自哈密轄區內部分鄉鎮奶牛場、養殖戶，根據試驗需要并結合生產實際，共選取846 頭奶牛作為試驗樣本。

1.3 試驗方法

1.3.1 PPD 皮內變態反應

結核菌素皮內變態反應按《動物結核病診斷技術GB/T 18645-2002》規定操作進行試驗，在牛頸部處注射牛結核菌素（2000IU/0.1ml），72h 后觀察注射部位炎性反應，量取皮皺厚，根據皮皺厚差值判斷結果。皮皺厚差值≥4.0mm，判為牛結核陽性；1.0～4.0mm 判為可疑；≤0mm 判為陰性。

1.3.2 γ-干擾素ELISA 檢測法

牛尾靜脈采集皮內PPD 變態反應試驗陽性群牛全血5ml，置于肝素抗凝管中，輕輕顛倒混勻，室溫下16h 內送到實驗室。具體操作參照試劑盒說明書進行牛結核菌素和禽結核菌素刺激培養和γ-干擾素檢測。結果判定標準：牛型PPD 刺激上清的OD 值-PBS 刺激上清的OD 值≥0.1，且牛型PPD 刺激上清的OD 值-禽型PPD≥0.1。

2 結果

2.1 檢測陽性率的比較分析

用皮內變態反應試驗對846 頭奶牛進行檢測，出現陽性牛34 頭，個體陽性率為4.02% (34/846)，其中牛型PPD 皮內變態反應試驗陽性群奶牛合計433 頭。對433 頭奶牛采集全血進行刺激培養和γ-干擾素ELISA 檢測，結果TST 方法檢出陽性34頭，陽性率為7.85% (34/433)，IFN-γ 方法檢出牛型PPD 陽性樣品25 份，禽型PPD 陽性樣品6 頭，陽性率為5.77% (25/433），結果如表1 所示。

2.2 皮內變態反應與γ-干擾素ELISA 檢測比較結果

對433 份樣本用γ-干擾素ELISA 檢測與皮內變態反應方法進行比對，結果皮內變態反應實驗檢出陽性34 頭，γ-干擾素ELISA 檢測檢出陽性25 頭，γ-干擾素ELISA 檢測與皮內變態反應實驗檢出的雙陽性牛為21 頭，雙陰性牛為395 頭，兩者之間的敏感性為84.00%，特異性為96.81%，符合率為96.07% （416/433），結果如表2 所示。

2.3 γ-干擾素ELISA 檢測不同飼養方式統計結果

由表3 可知，對433 份樣本飼養方式進行統計，農區散養戶160 份，牧區放牧養殖戶125 份，規模養殖場148 份。統計結果發現，規模場牛結核個體陽性率為10.81%，高于農區散養5.00%，均高于牧區放牧0.30%。

3 討論

準確診斷感染牛結核分枝桿菌的動物對牛結核病的控制和進化起至關重要的作用[1]。從檢測數據可以看出，若單獨使用皮內變態反應檢出的PPD 陽性牛既實行“檢疫—撲殺” 策略，必然造成假陽性牛被誤殺。

本試驗通過皮內變態反應試驗對846 頭奶牛進行檢測，出現陽性牛34 頭，但陽性畜群較少，陽性畜主要集中在小規模場，這與張喜悅等的研究結果相符，其發現規模場的個體陽性率和群陽性率均略高于散養戶。分析部分牛場可能存在牛結核分枝桿菌感染，通過皮內變態反應試驗沒有徹底根除陽性畜，造成病原擴散和疫情處置延誤，導致群內傳播。

γ-干擾素ELISA 檢測方法比其他檢測方法有更高的靈敏度和更快速地重復檢測能力，研究表明，γ-干擾素ELISA 檢測的敏感性范圍在73.0%～100.0%之間，特異性范圍在85.0%～99.6%之間，使用γ-干擾素ELISA 檢測可以彌補牛結核PPD 皮內變態反應的不足，疑似陽性牛無需等待42d 后的復檢，同時能準確鑒別禽型結核分枝桿菌或牛型結核分枝桿菌，這對皮內變態反應試驗來說是一個很好的補充。試驗結果顯示，在同時運用兩種方法的情況下，兩者之間的敏感性為84.00%，特異性為96.81%，符合率為96.07% （416/433），γ-干擾素ELISA 檢測的陽性牛數量明顯減少，可有效降低因假陽性被誤殺而造成的損失。

因此，在對牛群進行結核病檢測時，可結合當地實際情況開展工作。進而達到有效控制牛結核病傳播的目的。哈密市域多數養殖戶、農牧民實行春冬輪牧，夏季放牧、冬季舍飼的方式，牛場的地理位置是牛結核的風險因素之一[2]。分析不同飼養方式，陽性率從高到低分別為規模場、農區、牧區，規模場高發原因為陽性畜主要集中在其中一個規模場，推測更為深層次的原因可能與飼養模式和牛群密度等有關。分析不同品種，土種奶牛陽性率最低，其次分別是西蒙塔爾和荷斯坦奶牛，這可能與荷斯坦奶牛更易感病有關，具體原因有待進一步研究。

表1 不同方法檢測陽性率統計結果

表2 皮內變態反應與γ-干擾素ELISA 檢測比較結果

表3 不同飼養方式γ-干擾素ELISA 檢測統計結果