烏魯木齊地區不同健康狀態和飼養環境中寵物源沙門菌耐藥特征分析

軒慧勇，王凱，吾買爾江·牙合甫，高蕓，夏利寧

(新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

沙門菌是重要的人畜共患病原菌之一，可在一年中的任何時候引起人或動物發病，導致感染率增加[1]。隨著社會的發展，寵物數量不斷增加，犬和貓在寵物種類里占據較大的比重，由于人與犬、貓之間的親密接觸，增加人畜共患病發生的可能性，即使是沒有任何癥狀的健康犬和/或貓，也可能通過糞便、尿液等傳播沙門菌，并通過環境感染給其他動物和/或人[2-3]。隨著臨床上抗菌藥物的廣泛使用，寵物源沙門菌的耐藥性問題凸顯出來，高耐藥率和多重耐藥菌株的出現，導致人類和寵物沙門菌病的治療面臨難題[4]。隨著生活水平的提高，人們越來越致力于寵物福利，人類感染治療的首選抗生素也常用于小動物臨床[4]。目前我國并未建立小動物細菌耐藥性監測體系，無法指導小動物臨床抗生素合理使用和評估寵物源細菌耐藥性傳遞到人類的風險。因此，本研究采集不同飼養環境和不同健康狀態下寵物的肛拭子樣，從中分離沙門菌，進行藥物敏感性試驗與耐藥基因檢測，從而了解該地區不同飼養環境和不同健康狀態下寵物源沙門菌的耐藥與耐藥基因流行現狀，加強耐藥菌株的監測，減少耐藥菌株由寵物向人傳遞的幾率。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年7月對新疆烏魯木齊的6家寵物醫院和1家流浪動物救助站進行樣品采集(采集對象為犬和貓)，通過肛拭子在直腸采集樣品共307份，其中健康動物糞樣234份，患病動物糞樣73份，患病動物主要為消化系統疾病，其次為呼吸系統疾病和外傷。

1.2 質控菌株、培養基與試劑

大腸桿菌標準質控菌株ATCC25922購自天和微生物試劑有限公司(杭州)。麥康凱培養基、氯化鎂孔雀綠增菌液(rappaport-vassiliadis medium，MM)、MH(mueller-hinton)培養基和SS瓊脂均購自奧博星生物技術有限公司(北京)。

試劑：瓊脂糖膠回收試劑盒與EB染色液以及Marker Ⅱ、2×Tap PCR Master Mix，均購自天根生化科技有限公司(北京)；BstF5I酶購自NEB公司；瓊脂糖凝膠原產于西班牙。

1.3 沙門菌分離鑒定

從樣品管中吸取50 μL樣品至1 mL滅菌MM增菌液中，于37 ℃培養48 h后用滅菌接種環在SS瓊脂培養基上劃線，37 ℃恒溫培養18～24 h后，挑取中間黑色周圍透明的單菌落至1 mL MM增菌液中，增菌12 h后在沙門菌顯色培養基上劃線培養，挑取培養基上紫紅色單菌落并保存備用。由生物工程股份有限公司(上海)合成沙門菌管家基因invA引物，序列為：下游引物invA-R：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，上游引物invA-F：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAA CC-3′，擴增目的片段大小為284 bp[5]，對分離菌株進行驗證。將分離鑒定的沙門菌根據動物的健康狀態分為健康動物源與患病動物源兩類；根據不同飼養環境將分離的沙門菌分為流浪動物源與家養動物源兩類。

1.4 藥敏試驗

受試藥品：環丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NOF)、恩諾沙星(ENR)、阿莫西林/克拉維酸(A/C)、頭孢噻呋(CEF)、氨芐西林(AMP)、安普霉素(APR)、阿米卡星(AMK)、硫酸慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KANA)、四環素(TE)、氟苯尼考(FLR)，上述藥品的標準品/對照品均購自中國獸醫藥品監察所。運用瓊脂稀釋法[6]，對分離鑒定出的沙門菌進行抗菌藥物最小抑菌濃度(MICs)測定。

1.5 耐藥基因檢測

依據參考文獻[7-12]由生物工程股份有限公司(上海)分別合成β-內酰胺酶基因(blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaLAP-1、blaKPC、blaOXA和blaCMY-2)、PMQR因子(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib)、四環素類基因(tetA和tetB)、氨基糖苷類基因(armA、rmtB、aadA2和ant(3″)-Ia)、酰胺醇類基因(floR)引物，待引物收到后先要對其進行3 000 r/min離心2 min處理，再按引物說明要求進行稀釋，完成之后對上述22種耐藥基因分別進行PCR檢測。用BstF5I酶進行酶切已檢出aac(6′)-Ib基因的PCR產物，如果存在-cr突變情況，那么aac(6′)-Ib基因將失去BstF5I酶的限制性位點并出現不能被切割現象。再次通過觀察瓊脂糖凝膠電泳圖譜的條帶可以獲得aac(6′)-Ib基因中-cr有無突變現象。

1.6 統計分析

耐藥率差異統計采用SPSS 20.0軟件，用卡方檢驗做差異性顯著分析，結果以平均值的形式表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 不同健康狀態和不同飼養環境中寵物源沙門菌分離鑒定

圖1為SS瓊脂培養基上劃線，37 ℃培養18～24 h后沙門菌生長情況。圖2為部分沙門菌PCR鑒定結果，挑取的疑似沙門菌均含有invA基因，且目的條帶單一明亮，無雜帶。

圖1 分離菌在SS培養基上生長狀態

M. DNA Marker Ⅱ；1～22. 寵物源疑似沙門菌；23. 陽性對照；24. 陰性對照圖2 部分寵物源沙門菌invA基因檢測結果

從307株樣品中共分離出99株沙門菌，整體分離率為32.2%(99/307)。由表1可知，患病動物沙門菌分離率(53.4%，39/73)顯著高于健康動物沙門菌分離率(25.6%，60/234)(P<0.05)。此外，流浪動物沙門菌分離率(78.4%，29/37)顯著高于家養動物沙門菌分離率(25.9%，70/270)(P<0.05)。

表1 不同健康狀態和不同飼養環境的寵物源沙門菌分離結果

2.2 寵物源沙門菌的耐藥及多藥耐藥情況

99株寵物源沙門菌對四環素、環丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林和氟苯尼考這7種抗菌藥物的耐藥率依次為6.1%(6/99)、3.0%(3/99)、3.0%(3/99)、3.0%(3/99)、2.0%(2/99)、2.0%(2/99)和2.0%(2/99)；對頭孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、硫酸慶大霉素和卡那霉素這5種抗菌藥物100%敏感。

多藥耐藥結果顯示，99株寵物源沙門菌多藥耐藥以0耐為主(91.9%，91/99)，1耐次之，占5.1%(5/99)。4耐菌株、5耐菌株和7耐菌株各檢出1株，檢出率為1.0%。

2.2.1 不同健康狀態寵物源沙門菌的耐藥及多耐情況

由表2可知，健康寵物源沙門菌對四環素、環丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林和氟苯尼考這7種抗菌藥物的耐藥率均為1.7%(1/60)；患病寵物源沙門菌對四環素耐藥率最高為12.8%(5/39)，對環丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星的耐藥率均為5.2%(2/39)，對阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林和氟苯尼考這3種抗菌藥物的各檢出1株耐藥菌株，耐藥率為2.6%(1/39)；不同健康狀態寵物源沙門菌對頭孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、慶大霉素和卡那霉素這5種抗菌藥物100%敏感。

表2 不同健康狀態寵物源沙門菌對12種抗菌藥物的耐藥情況 %

多藥耐藥結果顯示：健康動物多藥耐藥以0耐為主(95%，57/60)，檢出2株1耐(3.3%，2/60)菌株和1株5耐菌株(1.7%，1/60)；患病動物多藥耐藥以0耐為主(87.1%，34/39)，檢出3株1耐菌株，占7.7%(3/39)，4耐菌株和7耐菌株各檢出1株，檢出率均為2.6%(1/39)。

2.2.2 不同飼養環境寵物源沙門菌的耐藥及多耐情況

由表3可知，流浪寵物源沙門菌對被檢的12種抗菌藥物100%敏感，無耐藥菌株檢出；家養寵物源沙門菌對四環素、環丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林和氟苯尼考這7種抗菌藥物的耐藥率依次為8.6%、4.3%、4.3%、4.3%、2.9%、2.9%和2.9%。

表3 不同飼養環境寵物源沙門菌對12種抗菌藥物的耐藥情況 %

多藥耐藥結果顯示：流浪動物寵物源沙門菌因無耐藥菌株檢出，故多藥耐藥為0耐(100.0%，29/29)；家養動物多藥耐藥以0耐為主(88.6%，62/70)，1耐次之，占7.1%(5/70)，4耐菌株、5耐菌株和7耐菌株各檢出1株，檢出率均為1.4%(1/70)。

2.3 寵物源沙門菌耐藥表型與耐藥基因型

寵物源沙門菌耐藥基因檢測結果如下：對floR的檢出率為3.0%(3/99)；ant(3″-Ia、tetA、tetB檢出率均為2.0%(2/99)；blaTEM、oqxA、aac(6′)-Ib檢出率均為1.0%(1/99)，對aac(6′)-Ib的PCR產物用BstF5I酶進行酶切，存在-cr變異，未檢出其他被檢耐藥基因。

耐藥率與耐藥基因檢出率比較發現，耐藥率稍高于耐藥基因檢出率，如對β-內酰胺類耐藥率為4.0%(4/99)，但相應基因檢出率為1.0%(1/99)；對喹諾酮類耐藥率為9.1%(9/99)，相應耐藥基因檢出率為2.0%(2/99)；對四環素類耐藥率為6.0%(6/99)，相應耐藥基因檢出率為4.0%(4/99)；對酰胺醇類耐藥率為2.0%(2/99)，耐藥基因檢出率為3.0%(3/99)；未檢出氨基糖苷類耐藥菌株，卻檢出2株氨基糖苷類耐藥基因。由此可見，耐藥率與耐藥基因檢出率基本一致。

耐藥基因共存統計發現，僅有2株沙門菌同時攜帶ant(3″)-Ia、tetA和tetB3種耐藥基因。檢測結果詳見表4，PCR產物電泳見圖3。

表4 沙門菌耐藥基因檢測結果 %

1～3. floR；4～5. tetA；6. oqxA；7. blaTEM；8. aac(6′)-Ib；9～10. ant(3″)-Ia；11～12. tetB；+. 陽性對照；-. 陰性對照；M. DNA Marker圖3 寵物源沙門菌耐藥基因PCR檢測

3 討論

3.1 不同健康狀態和飼養環境寵物源沙門菌分離情況分析

本試驗結果中寵物源沙門菌的分離率為32.2%(99/307)，略低于林亞軍等[13]報道的犬源沙門菌分離率(48.1%)，高于陳傳榮[2]報道的寵物犬沙門菌分離率(2.3%)。不同健康狀態寵物源沙門菌的分離結果顯示，患病動物沙門菌分離率(53.4%)顯著高于健康動物沙門菌分離率(25.6%)，分離率高于盛賢均等[14](健康動物沙門菌分離率為0，患病動物沙門菌分離率為20.0%～40.0%)和龔大春等[15](患病動物沙門菌分離率為27.8%)的報道。不同健康狀態沙門菌分離結果顯示，動物患病時會攜帶更多的沙門菌，可能增大沙門菌在動物間的傳播幾率。

不同飼養環境寵物源沙門菌分離結果顯示，流浪動物沙門菌分離率(78.4%)顯著高于家養動物沙門菌分離率(25.9%)，與廖志偉等[16]報道結果一致，即流浪動物沙門菌分離率(16.0%)高于家養動物沙門菌分離率(7.4%)。流浪動物會接觸其他各種各樣動物及其糞便，但又不能及時清潔，因而流浪動物糞便中沙門菌的分離率更高。

3.2 不同健康狀態和飼養環境寵物源沙門菌耐藥結果分析

本試驗中寵物源沙門菌整體耐藥情況不嚴重，對被檢抗菌藥物的耐藥率在0～6.1%，對四環素耐藥率最高(6.1%)，耐藥結果低于部分報道，如：陳傳榮[2]報道的17株寵物犬源沙門菌耐藥率在0～35.29%之間；Songsak等[17]報道的122株寵物源沙門菌耐藥率在0.8%～100%；王元蘭[18]報道的寵物犬沙門菌耐藥率在3.6%～27.6%之間。不同地區寵物源沙門菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率差異較大，可能與動物個體的健康狀態和用藥頻率有關；其次，不同寵物醫院使用的抗菌藥物及用藥療程不同也可能是造成寵物源沙門菌耐藥率差異大的原因之一。

本研究還發現，患病動物源菌株的耐藥率高于健康動物源菌株的耐藥率，可能是對患病動物進行治療的過程中，抗菌藥物的使用導致患病動物源菌株的耐藥率升高。此外，流浪動物沙門菌的耐藥率顯著低于家養動物沙門菌耐藥率，但流浪動物沙門菌分離率卻顯著高于家養動物，分析原因可能是流浪動物接觸抗菌藥物的機會少，流浪動物被沙門菌侵襲后，無用藥機會，多靠自身抵抗力恢復，所以流浪動物雖然沙門菌攜帶率較高，但這些沙門菌因為沒有用藥而對被檢抗菌藥物敏感；而家養動物接觸抗菌藥物機會多且用藥次數多，細菌在用藥壓力下可通過改變自身的代謝途徑或耐藥基因發生突變，導致藥物活性被抑制或失活，從而表現出耐藥或多藥耐藥[4]。

多藥耐藥結果顯示，烏魯木齊市寵物源沙門菌多藥耐藥主要集中在0耐(91.9%)和1耐(5.1%)，結果低于林亞軍等[13]報道的寵物源沙門菌8耐及以上耐藥菌株占97.4%；多藥耐藥結果遠低于其他動物源沙門菌多藥耐藥結果，如陳玲等[19]報道的動物源沙門菌多重耐藥率高達63.75%，關茹飛等[20]報道的雞源沙門菌的多藥耐藥結果11耐占15.0%。寵物源沙門菌多藥耐藥率低于其他動物源沙門菌多藥耐藥率，原因可能與寵物的生活環境有關，使其感染沙門菌的幾率較小。此外，寵物從發病、用藥到護理都能夠得到主人的關注，濫用藥物的機會少，可能也是寵物源沙門菌多藥耐藥率較低的原因之一。

3.3 寵物源沙門菌耐藥基因結果分析

本試驗耐藥基因檢出率非常低，對酰胺醇類耐藥基因floR檢出率最高，也僅為3.0%(3/99)，低于黃凱等[21](動物源floR檢出率為13.1%)和任士飛等[22](鴨源floR檢出率為30.6%)的報道。對四環素類和氨基糖苷類耐藥基因檢出率均為2.0%，遠低于軒慧勇等[23]寵物源tetB(100.0%)的檢測結果，但與侯雪嬌等[24]報道的食源性沙門菌tetB(3.5%)檢出率大致相同。本試驗寵物源沙門菌并沒有檢出氨基糖苷類藥物耐藥菌株，卻檢出氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-Ia，相關資料表明，細菌對一種藥物的耐藥可能是幾種耐藥基因和耐藥機制共同作用的結果[3]，分析耐藥基因ant(3″)-Ia可能不是介導細菌對氨基糖苷類藥物耐藥主導基因。

此外，PMQR因子和β-內酰胺酶類耐藥基因檢出率均為1.0%，低于林居純等[25]和黃巾凌等[26]報道的PMQR因子檢出率(oqxA檢出率在7.9%～24.6%，aac(6′)-Ib-cr檢測率在15.2%～27.5%)。Robicsek等[27]研究發現，aac(6′)-Ib-cr基因所介導的耐藥發生率明顯高于qnr基因介導的耐藥發生率，而aac(6′)-Ib-cr與其他PMQR因子共存現象更容易被檢測出來，從而使細菌獲得更高水平的耐藥，該研究結論可印證本試驗PMQR因子耐藥基因檢出結果。本研究僅檢出1株攜帶blaTEM基因的沙門菌，該菌株來源于患有犬瘟熱的寵物犬，推測在治療過程中，為防止病毒與細菌的交叉感染，采用β-內酰胺類抗菌藥物進行治療，進而導致β-內酰胺酶類耐藥基因的產生。

4 結論

新疆烏魯木齊市患病寵物源沙門菌的分離率及耐藥率高于健康寵物源沙門菌，流浪寵物源沙門菌的耐藥率低于家養寵物源沙門菌，所有菌株對被檢藥物的耐藥率均未超過10.0%，耐藥基因檢出率低，且耐藥表型與耐藥基因型之間呈正相關。結果提示，該地區寵物源沙門菌對被檢抗菌藥物具有較好的敏感性，故臨床上仍可使用頭孢菌素類和氨基糖苷類抗菌藥物用于犬、貓沙門菌病的治療。