高通量測(cè)序技術(shù)在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用

伍鋼，韋佳塔，張玉雪，陳海蘭，劉琪琦，江明生*

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

高通量測(cè)序(high-throughput sequencing, HTS)又稱(chēng)“下一代”測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)，是2005年以后逐步推出的一系列新測(cè)序方法的統(tǒng)稱(chēng)。它先從樣本中制備DNA文庫(kù)，然后采用PCR方法擴(kuò)增連接接頭后的文庫(kù)并利用磁珠進(jìn)行純化，再對(duì)磁珠純化后的文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模并行測(cè)序[1]。由Roche公司開(kāi)發(fā)的焦磷酸測(cè)序系統(tǒng)是市場(chǎng)上第一個(gè)商業(yè)化的HTS測(cè)序平臺(tái)，然后相繼出現(xiàn)了Illumina公司的Solexa平臺(tái)、Thermo Fisher公司的Ion Torrent平臺(tái)。

自從推出了第一個(gè)HTS平臺(tái)以后，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量和產(chǎn)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，使得DNA測(cè)序在技術(shù)上更簡(jiǎn)單、更快速、更便宜，大大加快了基因組研究的進(jìn)度，使其在流行病學(xué)研究、病原檢測(cè)、疾病診斷、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域的應(yīng)用得以快速推廣[2-5]。

雖然HTS技術(shù)已發(fā)展得相當(dāng)成熟，但其在獸醫(yī)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用相對(duì)較少。本文就近年來(lái)HTS在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)其在獸醫(yī)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望，旨在幫助獸醫(yī)研究和工作者更快的了解HTS技術(shù)，利用這個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)解決獸醫(yī)領(lǐng)域的問(wèn)題，促進(jìn)畜牧獸醫(yī)行業(yè)的健康快速發(fā)展。

1 高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

DNA序列的測(cè)定是分子生物學(xué)研究中一項(xiàng)非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容，基因的分離與定位、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因的表達(dá)與調(diào)控、基因與疾病的關(guān)系、藥物作用靶點(diǎn)等研究都依賴于對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。自1977年Sanger測(cè)序問(wèn)世以后，測(cè)序技術(shù)取得了巨大的發(fā)展，從第一代的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法、熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)和雜交測(cè)序技術(shù)，經(jīng)過(guò)了第二代的Solexa測(cè)序技術(shù)、SOLiD測(cè)序技術(shù)和454測(cè)序技術(shù)，最終進(jìn)入以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的第三代測(cè)序時(shí)代[6]。測(cè)序讀長(zhǎng)由長(zhǎng)至短再到長(zhǎng)，測(cè)序速度不斷提升，測(cè)序成本則顯著下降[7]。

1977年，Sanger采用化學(xué)降解法測(cè)定了噬菌體X174全長(zhǎng)5 375個(gè)堿基的序列，開(kāi)啟了基因組學(xué)時(shí)代[8]。2001年，美、英、法、德、日和中國(guó)6個(gè)國(guó)家采用Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈終止法聯(lián)合完成了首個(gè)人類(lèi)基因組圖譜的繪制，為人類(lèi)揭開(kāi)自身奧秘奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。第一代測(cè)序是以傳統(tǒng)的鏈終止法和化學(xué)降解法為原理的DNA測(cè)序法，它的讀長(zhǎng)可達(dá)1 000 bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，但其測(cè)序成本高、通量低、操作復(fù)雜和對(duì)有毒或放射性試劑的依賴，嚴(yán)重限制了它的大規(guī)模應(yīng)用[9]。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，人們進(jìn)入了后基因組時(shí)代(功能基因組時(shí)代)。為了克服Sanger測(cè)序法的不足，研究者們不斷地對(duì)測(cè)序技術(shù)進(jìn)行開(kāi)發(fā)和改進(jìn)，以尋求Sanger測(cè)序法的替代者，隨之誕生了以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa和Hiseq技術(shù)為代表的第二代測(cè)序技術(shù)[10]。HTS高通量的顯著特性使其在保持高度準(zhǔn)確性的同時(shí)極大地加快了測(cè)序進(jìn)程，使核酸測(cè)序的成本明顯降低，滿足了越來(lái)越多對(duì)時(shí)間和資源要求都很苛刻的大型基因組測(cè)序項(xiàng)目的需求[1]。近二三年，出現(xiàn)了無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增的單分子測(cè)序技術(shù)，被稱(chēng)為第三代測(cè)序技術(shù)，以O(shè)xford Nanopore Technologies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)和PacBio公司的SMRT為代表。

HTS技術(shù)的快速發(fā)展，給生命科學(xué)的研究帶來(lái)了極大的便利，被廣泛應(yīng)用于新物種(亞型)發(fā)現(xiàn)、基因表達(dá)分析、非編碼小分子RNA鑒定、轉(zhuǎn)錄因子靶基因篩選、DNA-蛋白質(zhì)相互作用等領(lǐng)域，對(duì)揭示生命本質(zhì)的研究起到了關(guān)鍵的作用[11]。該技術(shù)同樣被越來(lái)越多地應(yīng)用于動(dòng)物品種改良指導(dǎo)、畜禽疾病診斷、分子流行學(xué)研究、致病機(jī)理探索、耐藥性分析等畜牧獸醫(yī)的相關(guān)研究[12]。

2 高通量測(cè)序技術(shù)在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用

畜牧養(yǎng)殖業(yè)是關(guān)乎國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，HTS是在生命科學(xué)領(lǐng)域強(qiáng)勢(shì)崛起的新型技術(shù)，在畜禽疾病診斷、疾病監(jiān)測(cè)、致病機(jī)理探索、耐藥性分析等領(lǐng)域逐漸展現(xiàn)其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

2.1 高通量測(cè)序技術(shù)在畜禽疾病診斷中的應(yīng)用

動(dòng)物傳染病是由病原微生物引起的一種具有傳染性的疫病，近年來(lái)，我國(guó)動(dòng)物疫病呈現(xiàn)多發(fā)狀態(tài)，且多呈混合感染。例如，2018年暴發(fā)的非洲豬瘟(African swine fever，ASF)在短短幾個(gè)月內(nèi)迅速擴(kuò)散至全國(guó)，截至2019年7月底，全國(guó)31個(gè)省份暴發(fā)ASF疫情150起，其中家豬暴發(fā)146起，野豬暴發(fā)4起[13]。對(duì)病原體的快速、全面、準(zhǔn)確鑒定，是及時(shí)制定有效的防控措施、減少疾病傳播和損失的關(guān)鍵。基于單一目標(biāo)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)且操作復(fù)雜，難以滿足動(dòng)物傳染性疾病復(fù)雜、傳播快的特征，而采用HTS的宏基因組測(cè)序技術(shù)克服了多數(shù)病原體不能培養(yǎng)的限制，可準(zhǔn)確高效地獲得病原體全部的遺傳信息，從而直接快速鑒定出病原。2016年冬季，阿拉斯加州內(nèi)陸地區(qū)暴發(fā)的犬細(xì)小病毒(CPV)引起犬類(lèi)發(fā)病率和死亡率明顯增加[14]。Parker等[14]通過(guò)對(duì)12只疑似感染犬細(xì)小病毒的犬的12個(gè)直腸拭子標(biāo)本提取的靶向轉(zhuǎn)錄RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)發(fā)病率和死亡率的增加原因不是由于新型病毒的出現(xiàn)，而是由于未接種疫苗或疫苗接種劑量過(guò)低。基于HTS的全基因組比對(duì)分析在2014—2015年歐洲零星暴發(fā)的禽流感病毒H5N8的診斷中發(fā)揮了重要作用，Bouwstra等[15]對(duì)來(lái)自荷蘭的高致病性禽流感病毒進(jìn)行了遺傳分析，并與歐洲、韓國(guó)和日本的毒株進(jìn)行了比較，數(shù)據(jù)顯示病毒的傳播宿主可能是來(lái)自亞洲的候鳥(niǎo)。

遺傳性疾病也是嚴(yán)重威脅動(dòng)物養(yǎng)殖健康發(fā)展的因素之一，HTS技術(shù)可通過(guò)基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)分析，快速鑒定引起疾病的突變位點(diǎn)，改善對(duì)動(dòng)物遺傳缺陷的管理和控制。為了追求更高的生產(chǎn)性能，優(yōu)良品種動(dòng)物被大量推廣和使用，但該策略通常會(huì)引起遺傳缺陷的定期暴發(fā)。Sartelet等[16]采用全基因組關(guān)聯(lián)研究和HTS技術(shù)快速發(fā)現(xiàn)了引起比利時(shí)藍(lán)牛遺傳性關(guān)節(jié)病的31個(gè)候選點(diǎn)突變，其中 PIGH基因第一個(gè)內(nèi)含子(c 211-10C>G)中的一個(gè)C到G轉(zhuǎn)換，預(yù)計(jì)會(huì)影響到它的受體剪接位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生的PIGH 蛋白缺乏必要的結(jié)構(gòu)域，從而不具有生物學(xué)活性，這是引起比利時(shí)藍(lán)牛關(guān)節(jié)病的關(guān)鍵。

2.2 高通量測(cè)序技術(shù)在疾病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

隨著畜禽養(yǎng)殖的集約化和規(guī)模化發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖出現(xiàn)“老病不斷、新病頻發(fā)”的現(xiàn)象。應(yīng)用分子生物學(xué)理論與技術(shù)，從分子基因水平研究病因和流行因素，是國(guó)家、地方相關(guān)部門(mén)和企業(yè)主制定防控措施的依據(jù)。HTS技術(shù)可在微量條件下完成對(duì)臨床樣本中遺傳物質(zhì)的擴(kuò)增和分析，而不需要對(duì)病原體進(jìn)行分離培養(yǎng)，不需要設(shè)計(jì)目的序列的針對(duì)性引物，不依賴病原體遺傳背景[17]，在分子流行病學(xué)中HTS技術(shù)可以作為發(fā)現(xiàn)未知病原、識(shí)別和跟蹤傳播途徑等疾病監(jiān)測(cè)的重要工具[18]。

相比于傳統(tǒng)的耗時(shí)長(zhǎng)的未知病原的鑒定方法，如病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)分析、免疫電鏡觀察等，HTS技術(shù)不依賴于病原體遺傳背景和高通量的特點(diǎn)使其具有非常大的優(yōu)勢(shì)。Tang等[19]使用HTS技術(shù)對(duì)賓夕法尼亞州患有病毒性關(guān)節(jié)炎的肉雞中分離出的禽呼腸孤病毒(ARV)進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了與常見(jiàn)田間毒株不同的2個(gè)新毒株，包括野外變異種(Reo/PA/Broiler/15511/13或 PA15511)和(Reo/PA/Turkey/22342/13)。Andriyan等[20]使用HTS對(duì)2006—2007年間收集的美國(guó)感染西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)的禽類(lèi)樣品DNA進(jìn)行測(cè)序，鑒定出含有13個(gè)核苷酸缺失的新遺傳變異體。Chen等[21]利用RNA-Seq在對(duì)國(guó)內(nèi)家禽進(jìn)行的一項(xiàng)調(diào)查的過(guò)程中意外發(fā)現(xiàn)了一種新的冠狀病毒。2003年荷蘭暴發(fā)的H7N7高致病性禽流感導(dǎo)致近3 000萬(wàn)雞被捕殺、89人感染、1人死亡，調(diào)查人員采用Illumina深度測(cè)序?qū)悠愤M(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感病毒(H7N7)感染人后， PB2 E627K基因的突變頻率明顯增加[22]。

病原物種、亞型、分離株和變異株的多樣性使它們?cè)诙玖Α㈩A(yù)防接種、流行病學(xué)、診斷和治療等方面有著重要影響。HTS技術(shù)在研究病原體的遺傳多樣性與致病性之間的關(guān)系有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如通過(guò)獲取豬繁殖與吸吸障礙綜合征病毒(PRRSV)的完整基因組序列，或通過(guò)比較該病毒ORF5序列，可判斷暴發(fā)毒株的來(lái)源、傳播途徑和持續(xù)存在的原因[23]。Guyard-Nicodème[24]與Ohishi等[25]都采用HTS分析了人源性和雞源性空腸彎曲桿菌的分子流行病學(xué)特征，通過(guò)比較基因組學(xué)分析一致認(rèn)為食用被空腸彎曲桿菌污染的雞肉是其傳染給人的主要傳播途徑。

2.3 高通量測(cè)序技術(shù)在致病機(jī)理研究中的應(yīng)用

病原微生物感染宿主后，與宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)之間的博弈通常會(huì)導(dǎo)致自身基因組部分位點(diǎn)發(fā)生變異，從而使其逃逸宿主免疫系統(tǒng)對(duì)它的攻擊和清除，從而得以生存。此外，在藥物治療過(guò)程中，病原也可能通過(guò)基因突變改變藥物作用靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶，或改變代謝途徑等手段來(lái)逃避藥物的作用，產(chǎn)生對(duì)該類(lèi)藥物的耐藥性。HTS測(cè)序通過(guò)覆蓋靶基因位點(diǎn)數(shù)十倍甚至上百倍的深度測(cè)序，有效地展現(xiàn)病原微生物基因組發(fā)生的變化，揭示其致病機(jī)制，指導(dǎo)臨床防治。

臨床試驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，相比于其他的禽白血病病毒(ALV)，ALV-J亞型更具致病性，但原因不明[26]。Meng等[27]因此采用HTS技術(shù)對(duì)ALV和ALV-J的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ALV-J與人類(lèi)免疫缺陷病毒相似，具有很高的基因重組率，更容易發(fā)生突變，從而表現(xiàn)出廣泛的遺傳多樣性[28]。寧蓬勃[7]采用HTS技術(shù)對(duì)豬瘟病毒石門(mén)株感染與未感染的SUVEC基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異的研究發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒石門(mén)株可能利用改變宿主細(xì)胞復(fù)制周期、抗凋亡、抗炎癥等多種策略實(shí)現(xiàn)自身的復(fù)制增殖，并逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除。Barbosa等[29]采用HTS技術(shù)對(duì)澳大利亞考拉及考拉身上蜱蟲(chóng)中的錐蟲(chóng)群落進(jìn)行患病率和遺傳多樣性研究，在考拉中第一次發(fā)現(xiàn)了Trypanosomanoyesi的感染，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的錐蟲(chóng)種感染，此外得到了考拉中錐蟲(chóng)感染多為2種以上甚至多達(dá)5種錐蟲(chóng)的復(fù)合感染，為澳大利亞考拉錐蟲(chóng)病的治療提供了依據(jù)。對(duì)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF蛋白與宿主細(xì)胞調(diào)控相關(guān)功能的鑒定，有助于更好地了解斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的發(fā)病機(jī)制。在PCV2基因組中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的PCV2 ORF蛋白，即ORF5蛋白，但其在PCV2感染宿主的發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚[30]。Choi等[30]使用RNA-seq技術(shù)研究PCV2 ORF5在PCV2感染豬上皮細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)PCV2 ORF5可能通過(guò)抑制涉及Ⅰ型IFN合成的基因的轉(zhuǎn)錄從而抑制Ⅰ型干擾素(IFN)的表達(dá)，從而增強(qiáng)豬上皮細(xì)胞中PCV2的復(fù)制，指出PCV2 ORF5蛋白可能對(duì)宿主免疫監(jiān)測(cè)具有抑制作用。Bujold等[31]對(duì)6種不同類(lèi)別的13株放線桿菌進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，找出放線桿菌屬成員間的異同，識(shí)別放線桿菌屬某些成員侵襲機(jī)制中的決定因素，指出自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、唾液酸生物合成/代謝蛋白、IgA蛋白酶1可能與放線桿菌的侵襲性有關(guān)。Zysset-Burri等[32]利用HTS對(duì)致病性的福氏納格里阿米巴原蟲(chóng)和非致病性納格里原蟲(chóng)分別進(jìn)行全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，再結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析這2種原蟲(chóng)基因組的相似性和表達(dá)蛋白的差異性，確定了22個(gè)在人類(lèi)原發(fā)性阿米巴腦膜炎致病機(jī)制中發(fā)揮作用的蛋白，并通過(guò)這些蛋白的功能注釋提出了細(xì)胞膜可能是這些原蟲(chóng)發(fā)揮其致病潛能的主要場(chǎng)所的觀點(diǎn)。

2.4 高通量測(cè)序技術(shù)在病原耐藥性研究中的應(yīng)用

抗生素的耐藥性問(wèn)題已成為全世界共同面對(duì)的難題之一，據(jù)估計(jì)到2050年，全球每年將有1 000萬(wàn)人死于細(xì)菌耐藥，超過(guò)目前每年死于癌癥的820萬(wàn)人，直接造成的經(jīng)濟(jì)損失將會(huì)達(dá)到約100萬(wàn)億[33]。動(dòng)物養(yǎng)殖出現(xiàn)越來(lái)越多難以控制和治療的感染性疾病，每年造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。HTS技術(shù)通過(guò)對(duì)病原微生物全基因組的高通量測(cè)序，可快速獲取耐藥基因、轉(zhuǎn)座子序列和耐藥菌進(jìn)化軌跡等信息，對(duì)研究耐藥性的遺傳變化規(guī)律和耐藥機(jī)制具有重大意義[34]。銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制是合成SPM-1金屬β-內(nèi)酰胺酶，Nascimento等[35]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)6株產(chǎn)SPM-1金屬β-內(nèi)酰胺酶銅綠假單胞菌ST277進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后與標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組進(jìn)行比對(duì)，一共檢測(cè)到 26個(gè)基因組島，從中發(fā)現(xiàn)了一些參與銅綠假單胞菌耐藥過(guò)程相關(guān)的基因，并且還發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)導(dǎo)致抗菌藥物耐藥性和毒力相關(guān)基因的氨基酸變化，為繼續(xù)深入研究銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

通過(guò)高通量測(cè)序不僅可以快速鑒定出耐藥基因，還可以確定耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制[36]。Binh等[37]采用HTS技術(shù)就對(duì)3種克拉霉素敏感及耐藥的幽門(mén)螺桿菌的基因組DNA進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)高抗藥性致病菌內(nèi)含有23S rRNA基因的A2143G點(diǎn)突變，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了與克拉霉素抗藥性有關(guān)的2個(gè)新突變位點(diǎn)infB和rpl22。使用HTS技術(shù)對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的研究發(fā)現(xiàn)，移動(dòng)遺傳元件SCCmec可以攜帶mecA基因進(jìn)入對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌內(nèi)，使其獲得對(duì)甲氧西林的耐藥特性[38]。朱陣[36]采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定的福氏志賀菌基因序列與de novo 序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)metG、gyrB、gydA、rob、narX等多個(gè)基因序列及其他的間區(qū)均存在突變位點(diǎn)，其中甲硫氨酰tRNA合成酶metG和酞酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶ppiA的基因位點(diǎn)突變與福氏志賀菌的耐藥性有關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該菌種環(huán)丙沙星藥物的作用靶點(diǎn)gyrB基因。孔令聰[39]利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)單個(gè)堿基突變的gyrA基因即可導(dǎo)致牛A型多殺性巴氏桿菌菌株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性，高度耐藥時(shí)gyrA基因第83位，parC第80、84位堿基同時(shí)發(fā)生點(diǎn)突變，這些突變抑制了藥物與細(xì)菌表面藥物作用靶位的結(jié)合；而牛A型多殺性巴氏桿菌23S rRNA第2 059位的堿基置換則引起菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥。

3 前景與展望

HTS技術(shù)革新了基因組研究的格局，測(cè)序深度和分辨率的提高使基因組的探究達(dá)到了更高的層次，加深了對(duì)人類(lèi)、動(dòng)物和病原體基因組復(fù)雜性與動(dòng)物傳染病的進(jìn)化、傳播方式和致病性的理解[40]。自改革開(kāi)放以來(lái)，我國(guó)的畜牧業(yè)總產(chǎn)值一直處于上升態(tài)勢(shì)，2017年超過(guò)3.2萬(wàn)億，占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值比例的30%，帶動(dòng)上下游相關(guān)產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值3萬(wàn)億元以上。但畜牧業(yè)具有集中化、規(guī)模化的特點(diǎn)，容易引起病原體大規(guī)模的傳播和感染。

目前獸醫(yī)臨床上主要采用藥敏試驗(yàn)、PCR等分子生物學(xué)手段對(duì)畜禽病原體耐藥菌株進(jìn)行鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果強(qiáng)化病原體耐藥性監(jiān)測(cè)，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和蔓延，制定防控措施[41]。但是，藥敏試驗(yàn)需要經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)才能檢測(cè)到臨床樣本里的耐藥菌株，其周期較長(zhǎng)，培養(yǎng)條件受限制的菌株不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[42]。多重PCR技術(shù)可直接檢測(cè)培養(yǎng)物或臨床樣本的耐藥基因，但是基于PCR的耐藥基因檢測(cè)方法只能檢測(cè)已知耐藥基因且檢測(cè)通量有限[43]。而可對(duì)大量核酸進(jìn)行無(wú)差異序列測(cè)定的高通量測(cè)序技術(shù)則有很大優(yōu)勢(shì)，不但可以快速檢測(cè)出多種致病病原體，還可有效發(fā)現(xiàn)未知病原，不需要培養(yǎng)菌株就可檢測(cè)在單個(gè)樣本中同時(shí)存在的多個(gè)不同的病原體和耐藥基因[21,44]，對(duì)于細(xì)菌耐藥性臨床監(jiān)測(cè)、疾病診斷、流行病學(xué)研究及指導(dǎo)防控措施的制定都有著重要意義。此外，高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析對(duì)病原體基因組遺傳特征的研究，可幫助科研人員預(yù)測(cè)和篩選合適的病毒抗原表位，確定可用于疫苗開(kāi)發(fā)的基因序列[40,45]。HTS技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)的結(jié)合可以在基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、翻譯3個(gè)階段對(duì)致病基因位點(diǎn)突變的精確鑒定，可有效指導(dǎo)致病機(jī)理的分析，藥物作用靶點(diǎn)的確定和新藥的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)，為后期動(dòng)物傳染病的預(yù)防和治療奠定理論基礎(chǔ)[45]。

與常規(guī)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段相比，HTS擁有比較大的優(yōu)勢(shì)。但HTS運(yùn)行設(shè)備及試劑耗材的高昂價(jià)格，后期數(shù)據(jù)分析要求的豐富生物信息學(xué)經(jīng)驗(yàn)，以及HTS研究方法的標(biāo)準(zhǔn)與序列數(shù)據(jù)生成、分析、注釋和報(bào)告流程規(guī)范的缺失和不完善，極大地限制了HTS在獸醫(yī)臨床的廣泛應(yīng)用[45-47]。因此，為了充分發(fā)揮HTS在畜禽疾病防治、疾病監(jiān)測(cè)、致病機(jī)理探索、耐藥性控制、藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域中的作用，需要研制成本更低的設(shè)備，開(kāi)發(fā)價(jià)格更低的配套試劑和耗材，同時(shí)提高用戶友好性和診斷實(shí)驗(yàn)室的可訪問(wèn)性，使非專(zhuān)業(yè)用戶更方便對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析[11]。目前測(cè)序程序在大型臨床實(shí)驗(yàn)室和公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室正在朝自動(dòng)化的方向發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理和分析也正在開(kāi)發(fā)中，未來(lái)需要將測(cè)序和數(shù)據(jù)分析整合到一個(gè)有效的工作流程中，實(shí)現(xiàn)在獸醫(yī)臨床中HTS使用的全自動(dòng)化[8]。在將來(lái)用戶只需要將細(xì)菌培養(yǎng)物/樣本加載到測(cè)序儀的DNA制備模塊中，無(wú)需人工交互，直接生成針對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室需求定制的標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告并將其存儲(chǔ)在實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)(LIMS)數(shù)據(jù)庫(kù)中，提供實(shí)時(shí)的疾病監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，及時(shí)制定有效防控措施[19]。

無(wú)可置疑，HTS已經(jīng)給獸醫(yī)臨床工作帶來(lái)了巨大的變革。相信隨著成本的降低和技術(shù)的改進(jìn)，HTS技術(shù)在獸醫(yī)臨床中勢(shì)必會(huì)成為必不可少的診斷工具并發(fā)揮舉足輕重的作用，提高疾病診斷和藥物研發(fā)的效率，促進(jìn)養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展。