3株H9亞型禽流感病毒的分離與鑒定

吳憶春

(濱州職業學院生物工程學院，山東 濱州 256603)

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一種高度接觸性傳染病，可感染各種家禽和野禽。根據AIV致病性的不同可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒，其中H9亞型AIV屬于低致病性禽流感病毒[1]。H9病毒最早于1966年在患有溫和呼吸道癥狀的火雞中首次分離出來，我國最早于1994年由陳伯倫等[2]在蛋雞產蛋量下降14%～75%的廣東雞場中首次分離。雖然H9亞型AIV對禽類造成的臨床癥狀較溫和，但其可以引起免疫抑制[1，3]，常常與其他致病原混合感染加重疫病的危害程度，例如與大腸桿菌[4-5]、沙門菌[6]、呼腸孤病毒[7]等致病原的混合感染均對養殖業造成了巨大的經濟損失。H9亞型AIV能與其他亞型AIV進行基因重組形成新型重組病毒[1，8]，例如2013年以來國內發生的人感染H7N9高致病性禽流感病毒中，H9亞型AIV即向H7N9高致病性禽流感病毒提供了內部基因[9]，因此H9亞型AIV對公共衛生安全可造成不容忽視的潛在威脅。H9亞型AIV經過數十年的遺傳演化，目前已成為我國當前AIV流行的主要亞型，加強對H9亞型AIV流行毒株的分離鑒定和致病性研究對我國AI綜合防控具有重要的理論和現實指導意義。鑒于此，本研究對山東地區疑似H9亞型AIV感染的3份病料進行了病毒分離、HA基因序列分析、致病性分析、交叉保護性分析等系列試驗研究，最終獲得了3株H9亞型AIV流行毒株，為探討我國H9亞型AIV流行與遺傳變異規律，研究H9亞型AIV抗原差異性，指導H9亞型AIV免疫預防工作奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF雞、SPF雞胚均購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 主要試劑與疫苗

病毒基因組RNA提取試劑盒為AXYGEN公司產品；一步法RT-PCR擴增試劑盒、pMD18-T載體均為寶生物工程(大連)有限公司產品；柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒均為生工生物工程(上海)股份有限公司產品；禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)為山東綠都生物科技有限公司產品。

1.3 臨床病料的采集與處理

對3份山東地區(濱州、東營、濰坊各1份)疑似H9亞型禽流感病毒感染的病料，無菌采集病死雞的氣管、肺臟、腎臟等病變組織，按1∶3比例加入滅菌生理鹽水溶解、搗碎、碾磨，研磨后的組織勻漿經12 000 r/min離心15 min，吸取上清液經0.45 μm 濾膜過濾，濾液即為處理后的臨床病料樣品，用于后續的RT-PCR檢測和病毒分離試驗。

1.4 病毒分離

取處理后的臨床病料樣品2.0 mL，接種10日齡SPF雞胚10個，0.2 mL/胚，接種后每天照胚觀察雞胚死亡情況，舍棄24 h內死亡胚，將24～120 h死胚放置4 ℃冰箱保存，120 h后收集死亡雞胚尿囊液，并觀察雞胚的病變情況。按照同樣的試驗方法在雞胚上連續傳三代，無菌收集雞胚尿囊液，-20 ℃保存備用。

1.5 血凝試驗

取分離毒株的第三代雞胚尿囊液，按照常規微量血凝試驗操作方法測定其對1%雞紅細胞的凝集效價。

1.6 雞胚半數感染量(EID50)的測定

取分離毒株的第三代雞胚尿囊液，利用滅菌生理鹽水將其依次作10倍系列稀釋，每一個稀釋度尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0.1 mL/胚，37 ℃孵育觀察120 h，24 h以內的死胚棄去不計，記錄24～120 h各稀釋度雞胚死亡情況。至120 h將全部雞胚解剖，死胚與活胚均測定其對1%雞紅細胞的凝集效價，凝集效價大于等于1∶128即判為感染，按照Reed-Mench方法計算分離毒株的EID50。

1.7 HA基因序列分析

1.7.1 引物設計

根據GenBank中H9亞型AIV基因序列設計合成擴增HA基因全長引物，引物序列為H9-F：5′-ATGGAGACAGTATCAC-3′，H9-R：5′-TTATATACAAATGTTG-3′，預期擴增片段大小約為1 683 bp。

1.7.2 HA基因PCR擴增

分別取3個分離毒株的第三代雞胚尿囊液200 μL，用病毒基因組RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA。利用一步法試劑盒擴增HA基因，反應體系為：2×Buffer 25 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，酶1 μL，RNA 10 μL，補水至50 μL。一步RT-PCR反應程序為：50 ℃ 60 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。RT-PCR擴增結束后經核酸電泳觀察擴增片段大小。

1.7.3 HA基因遺傳變異特征

利用膠回收試劑盒對RT-PCR擴增的目的片段進行回收純化，回收產物連接至pMD18-T克隆載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，利用質粒小量提取試劑盒提取重組質粒，克隆質粒分別命名為pMD-BZ、pMD-DY、pMD-WF，利用BamHⅠ、XhoⅠ進行雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序測定。下載GenBank中登錄的部分H9亞型AIV HA基因序列，利用DNAStar生物學軟件將分離毒株HA基因測序結果與GenBank中登錄的H9亞型AIV HA基因序列進行核苷酸同源性比較分析，并構建系統進化樹。

1.8 致病性試驗

將40只14日齡SPF雛雞隨機分為4組(A、B、C、D)，每組10只SPF雛雞，A、B、C組的10只SPF雛雞以點眼、滴鼻方式分別接種3個分離毒株，0.2 mL/只，D組的10只SPF雛雞以點眼、滴鼻方式接種滅菌生理鹽水，各處理組分別置于不同隔離器中隔離飼養，觀察至14 d，每日觀察SPF雛雞的精神狀態、食欲以及呼吸道臨床癥狀，記錄發病和死亡情況。

1.9 交叉保護性試驗

將分離毒株用終濃度為0.1%的甲醛滅活后，以1∶3的比例加入油相中，中速混合均勻后高速乳化，制備成油乳劑滅活疫苗。將150只21日齡SPF雛雞隨機分為5組，每組30只雛雞，1～3組試驗雛雞分別胸部肌肉注射3個分離毒株制備的滅活疫苗，0.2 mL/只；第4組試驗雛雞胸部肌肉注射禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)，0.2 mL/只；第5組試驗雛雞注射滅菌生理鹽水，0.2 mL/只。至免疫后21 d，將每組的30只雞隨機分為3個小組，每個小組10只，3個小組分別攻擊3個分離毒株。至攻毒后5 d，逐只采集各處理組SPF雛雞的喉拭子和泄殖腔拭子，按照1.3的方法對采集的拭子進行處理，按照1.4和1.5的方法對處理后的拭子接種SPF雞胚進行病毒分離和血凝性測定，通過病毒分離結果確定試驗雛雞的排毒情況，分析不同分離毒株與商品化疫苗的交叉保護情況。

2 結果與分析

2.1 病毒分離

3份臨床病料樣品接種SPF雞胚后，SPF雞胚均在接種后72～96 h全部死亡，無菌收集第三代雞胚尿囊液，分別命名為BZ株、DY株和WF株。

2.2 分離毒株的血凝性

取分離毒株的第三代雞胚尿囊液，按照常規微量血凝試驗操作方法測定BZ株、DY株和WF株分離毒株對1%雞紅細胞的凝集效價分別為10log2、11log2和10log2。

2.3 分離毒株的EID50

按Reed-Muench法測定BZ株、DY株和WF株分離毒株對SPF雞胚的EID50分別為10-8.83/mL、10-9.50/mL和10-9.0/mL。

2.4 分離毒株的HA基因序列

如圖1所示，BZ株、DY株和WF株的HA基因RT-PCR擴增產物在1 683 bp處出現特異性擴增條帶，擴增片段大小均與預期相符。如圖2所示，克隆質粒pMD-BZ、pMD-DY、pMD-WF經BamHⅠ、XhoⅠ酶切后的酶切產物均具有大小為1 683 bp的特異性條帶，與預期結果完全一致。HA基因核苷酸同源性比較和系統進化樹分析分別如圖3、圖4所示，綜合比較3個H9亞型AIV分離毒株與2010—2018年的部分H9亞型AIV分離毒株的基因組序列，BZ株、DY株、WF株分離毒株與2018年分離自上海的幾株AIV(MK552788.1、MK552797.1、MK552786.1、MK053846.1、MK552795.1)親緣關系較近，進化樹處于同一分支。BZ株與DY株核苷酸同源性較高，達99.8%；WF株與BZ株核苷酸同源性達98.6%；WF株與DY株核苷酸同源性達98.5%。BZ株、DY株、WF株與2011年分離自廣西的JF715044毒株同源性均較低，核苷酸同源性分別為86.8%、86.8%和87.0%，BZ株、DY株、WF株與大部分H9亞型AIV核苷酸同源性在93.6%～98.6%之間，從分子水平鑒定3株分離毒株均為H9亞型禽流感病毒。

M. DL2000 Marker；1. BZ株；2. DY株；3. WF株；4. 陰性對照圖1 HA基因RT-PCR擴增結果

M. DL2000 Marker；1. BZ株；2. DY株；3. WF株圖2 重組質粒酶切鑒定結果

圖3 分離毒株HA基因核苷酸同源性比較

注：?表示本試驗分離株圖4 分離毒株HA基因系統進化樹分析

2.5 分離毒株的致病性

各處理組試驗雛雞的發病和死亡情況如表1所示，DY株攻擊的10只試驗雛雞在攻毒后第3天即有部分SPF雛雞表現出精神沉郁、食欲下降、以及咳嗽、噴嚏、甩頭等呼吸道癥狀，隨后癥狀逐漸加重，并伴隨有綠色糞便排出，至攻毒后第8 天呼吸道癥狀逐步減輕，精神和食欲逐步恢復正常。DY株病毒攻擊的10只試驗雛雞均發病，其中嚴重呼吸道癥狀發病率和輕微呼吸道癥狀發病率分別為70%和30%。BZ株、WF株攻擊的10只試驗雛雞也有精神沉郁、食欲下降、以及咳嗽、噴嚏、甩頭等呼吸道癥狀，但均較DY株攻毒雞臨床癥狀輕。BZ株、WF株攻擊雛雞后的發病率分別為80%和90%，嚴重呼吸道癥狀發病率分別為10%和20%，輕微呼吸道癥狀發病率均為70%。3個分離毒株攻擊的試驗雛雞均未出現死亡，表明BZ株、DY株、WF株均為低致病性毒株，其中DY株的致病性稍微強于BZ株和WF株。

表1 試驗雛雞發病和死亡情況

2.6 分離毒株的交叉保護性

如表2所示，生理鹽水免疫組的30只試驗雛雞經3株分離毒株分別攻擊后，均能分離到病毒。在4個滅活疫苗免疫組中，只有禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)經DY株攻擊后有1只雛雞能分離到病毒，其余雛雞經3株分離毒株分別攻擊后均未能分離到病毒，說明3株分離毒株彼此之間均具有100%的交叉保護力，禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)對BZ株、WF株均具有100%的交叉保護力，對DY株具有90%的交叉保護力。研究表明，當前商品化H9亞型禽流感滅活疫苗對H9流行毒株仍具有較好的免疫保護效果。

表2 拭子病毒分離結果

3 討論

AIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，基因組包括8個單股負鏈RNA，依次編碼聚合酶蛋白PB2、PB1、PA，血凝素蛋白(HA)，核蛋白(NP)，神經氨酸酶(NA)，基質蛋白(M)和非結構蛋白(NS)，其中HA蛋白是病毒最主要的2種表面糖蛋白之一，在AIV復制過程中起關鍵作用，直接參與AIV的致病過程，是AIV的主要毒力因子和保護性抗原。根據HA抗原性的不同可將AIV分為18種HA亞型(H1～H18)[10-12]。近年來H9亞型AIV疫苗免疫雞群仍然不斷發生H9亞型AIV感染，使得該亞型AIV的變異性研究成為熱點。研究學者陸續進行了不同地區H9亞型AIV流行毒株HA基因的遺傳變異監測。高緒慧等[13]對2017年山東地區16株H9亞型AIV流行毒株HA基因進行同源性分析，結果發現核苷酸序列同源性為91.2%～99.8%，氨基酸同源性為93.6%～100.0%，表明山東地區H9亞型AIV發生了部分新的遺傳進化。萬永虎等[14]對2015—2017年貴州省13株H9亞型AIV流行毒株HA基因進行遺傳變異分析，證實均屬于DK/HK/Y280/97分支，但HA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為96.1%～99.9%和95.7%～100%，病毒一直處于不斷的變異之中。仇微紅等[15]對2013—2018年中國部分地區分離的69株H9亞型AIV的HA基因進行分析，69株毒株屬于H9.4.2.5分支，核苷酸相似性為83.7%～99.9%，氨基酸相似性為85.8%～99.9%，與現有疫苗毒株核苷酸同源性存在較大的差異。本試驗結果表明3株H9亞型AIV分離毒株與2018年上海分離毒株親緣關系較近，HA基因核苷酸同源性較高，而與2011年廣西分離毒株同源性較低，表明H9亞型AIV分離毒株HA基因呈現區域性分化的特點，其在我國隨著流行時間發生了較大遺傳分化。

H9亞型AIV分離毒株HA基因序列的變異是否引起分離毒株致病性的增加，以及現有商品化疫苗對流行毒株是否具有保護效果，這是對當前指導H9亞型AIV綜合防控工作最為重要的。本研究交叉保護性試驗結果顯示，3株分離毒株彼此之間均具有100%的交叉保護效果，商品化的禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)對3株分離毒株的保護效果達90%～100%，說明當前商品化H9亞型AIV滅活疫苗對流行毒株仍然具有良好的免疫保護效果，也在一定程度上說明現有商品化疫苗能夠滿足H9亞型AIV流行毒株的疫病防控要求。對于當前H9亞型AIV疫苗免疫養殖場仍然發生H9亞型AIV流行的情況，分析可能與飼養管理不當、疫苗質量下降、免疫程序不合理、注射方法不準確、免疫抑制病感染等因素密切相關，而不能完全歸結于H9亞型AIV流行毒株發生變異引起的免疫失敗。