鳳尾草提取物抗腹瀉的藥理學研究

南蘋瑤，王立琦，鮑光明，郭小權，王小鶯*

（1.江西農業大學獸藥研究所，江西南昌 330045；2.陜西省渭南市動物疫病預防控制中心，陜西渭南 714000）

【研究意義】在畜牧生產中，畜禽腹瀉是養殖生產的一類常見疾病，嚴重阻礙養殖業的發展[1?2]。為防治疾病及促進生產，大量抗菌藥物應用于養殖生產從而導致抗菌藥物的濫用，引起藥物殘留，細菌耐藥譜不斷擴大。因此，尋找一種安全有效的治療腹瀉的高產天然藥物至關重要。中藥鳳尾草歷史悠久、資源豐厚，具有廣譜抗菌、抗腫瘤及保肝作用[3]。其能治痢疾、腸炎、肝炎等[4]。鳳尾草在獸醫臨床上對豬、禽、牛、兔的痢疾能起治療作用。研究鳳尾草提取物抗腹瀉的藥理試驗，為開發鳳尾草資源提供理論依據?！厩叭搜芯窟M展】鳳尾草的藥用價值高，臨床治療效果優良。陳明仁[5]研究表明，鳳尾草合番石榴葉對急性濕熱型腹瀉具有良好的治療作用；胡荷斌等[6]以復方鳳尾草膠囊治療小腸濕熱和小兒消化不良，發現其對急性腸炎、慢性局限性腸炎及小兒腹瀉的顯效率分別為94%、97.4%及93.3%；【本研究切入點】鳳尾草作為一種歷史悠久的中藥，國內外對鳳尾草提取物抗腹瀉的藥理研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本文通過研究鳳尾草提取物對小鼠小腸推進運動和胃排空的影響，醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的抑制作用、蓖麻油致小鼠腹瀉的對抗作用，在抗炎、止瀉等方面探究鳳尾草提取物抗腹瀉的藥理學作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 受試藥與試劑 鳳尾草，全草采摘于江西省南昌市梅嶺風景區內。

0.7%醋酸生理鹽水溶液的配制：移液槍準確吸取0.35 mL純冰醋酸，溶于50 mL的生理鹽水中。

0.5%伊文思藍生理鹽水溶液的配制：精確稱取伊文思藍0.5 g，充分溶解于100 mL的生理鹽水中。

多潘立酮混懸液的制備：多潘立酮片10 mg/片，將多潘立酮片用研缽充分研磨至粉末，多潘立酮以15 mg/kg的劑量，用蒸餾水按5 g/L的濃度加羧甲基纖維素鈉配成1.5 mg/mL的混懸液。

阿司匹林混懸液：阿司匹林腸溶片100 mg/片，腸溶片用研缽充分研磨至粉末，將阿司匹林腸溶片以5 g/L的濃度加羧甲基纖維素鈉制成20 mg/mL的水懸液，以0.2 g/kg劑量進行灌胃，按0.1 mL/10 g灌胃給藥。

LB肉湯培養基、普通營養瓊脂培養基按常規方法來配制，121 ℃高壓滅菌處理，4 ℃保存備用。

半固體營養糊的制備：分別準確稱取8 g奶粉、4 g糖、1 g活性炭末和4 g淀粉溶于125 mL蒸餾水中，加入5 g羧甲基纖維素（CMC），一邊以電爐加熱一邊攪拌，使羧甲基纖維素盡量溶解。配制成100 mL約100 g的黑色半固體糊狀物。冰箱4 ℃冷藏備用，用時水浴鍋預熱至37 ℃。

炭末懸液的制備：準確稱取5 g活性炭末、1 g羧甲基纖維素（CMC）溶于100 mL雙蒸水中，邊加熱邊攪拌均勻制備成炭末懸液，冰箱4℃冷藏備用，使用時水浴鍋預熱至37℃。

1.1.2 主要儀器 50 g高速萬能粉碎機（DFT?50A，溫嶺市林大機械有限公司）；循環水式真空泵（SHZ?D（Ⅲ），鞏義市予華儀器有限責任公司）；旋轉蒸發儀（ValueDightal G3，上海亞榮生化儀器廠）；數顯恒溫水浴鍋（HH?4，國華電器有限公司）；

1.2 試驗方法

1.2.1 鳳尾草乙醇提取物的制備 將采摘的鳳尾草全草洗凈、曬干或放置在烘箱內烘干，中藥粉碎機粉碎成粉末，密封保存隨時干燥。準確稱取100 g鳳尾草粉末，粉末用濾紙包成長條形，按照料液比為1∶30，用70%乙醇溶液將濾紙浸泡在圓底燒瓶內，提取溫度為50 ℃，乙醇回流提取3次，每次30 min，合并3次提取液。所得提取液即為鳳尾草的乙醇粗提液，溫度控制在60 ℃，提取液用旋轉蒸發儀進行濃縮，回收乙醇，將醇提物濃縮至少量液體后，倒入25 mL干燥的小燒杯內，40 ℃干燥至膏狀物，至質量不變。膏狀物于?20 ℃冷凍保存。臨用前用10%的DMSO溶液溶解制成所需藥液，4 ℃冷藏保存備用。

1.2.2 鳳尾草對正常小鼠小腸推進運動和胃排空的影響 取健康小鼠36只，體質量18～22 g，雌雄各半，隨機分為正常對照組、鳳尾草乙醇提取物高、低劑量組3組，每組各12只，雌雄各6只，雌雄分籠飼養，做好標記。正常對照組小鼠按0.1 mL/20 g灌胃生理鹽水，鳳尾草乙醇提取物高劑量組、低劑量組分別以5 g/kg、2.5 g/kg劑量，按0.1 mL/20 g灌胃稀釋好的鳳尾草提取液，連續給藥4 d，末次給藥前禁食24 h，禁水2 h，給藥后1 h每只小鼠以0.6 mL/只灌胃半固體炭末混懸液，給完20 min后脫頸椎處死所有小鼠，開腹，結扎胃賁門和幽門，小心取下胃，用濾紙拭干后稱胃全質量，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內容物后濾紙拭干，稱胃凈質量[7]。胃內殘留物質量為胃全質量和胃凈質量的差值，胃內殘留率為胃內殘留物占所灌半固體糊狀物質量的百分比。同時迅速取出小腸全腸，輕輕剝離腸系膜后將小腸拉成直線，測量幽門至回盲部的小腸全長[8]，及炭墨推進長度為幽門至黑色半固體糊前沿的距離。以炭墨推進長度占幽門至回盲腸部全長的百分率為小腸推進率。試驗中所得數據應用SPSS17.0做數據處理，進行組間獨立樣本t檢驗，以表示。

1.2.3 鳳尾草對多潘立酮負荷下的小鼠小腸推進作用 取健康小鼠30只，體質量18～22 g，雌雄各半，隨機分為正常對照組、單純多潘立酮組、單藥鳳尾草乙醇提取物組3組，每組小鼠各10只，雌雄各5只，雌雄分籠飼養，做好標記（以左上/右上/左下/右下/不標記區分）。正常對照組和單純多潘立酮組組小鼠按0.1 mL/10 g灌胃生理鹽水，鳳尾草乙醇提取物組以5 g/kg、0.1 mL/10 g劑量灌胃稀釋好的中藥提取液，連續給藥4 d，末次給藥前禁食12 h，禁水2 h，除正常對照組外，其他組均以0.1 mL/10 g先灌胃多潘立酮混懸液，灌胃完后30 min，正常對照組和單純多潘立酮組灌胃等體積生理鹽水，鳳尾草乙醇提取物組灌胃中藥提取液，灌胃給藥30 min后，按0.25 mL/10 g給予炭末灌胃，20 min后采用頸椎脫臼法處死所有小鼠，開腹，結扎胃幽門，迅速取出小腸，輕輕剝離腸系膜后將小腸拉成直線，測量幽門至回盲部的長度為小腸全長，幽門至炭墨前沿的距離為炭墨推進長度[9]。以炭墨推進長度占幽門至回盲腸部全長的百分率為小腸推進率。試驗中所得數據應用SPSS17.0做數據處理，進行組間獨立樣本t檢驗，以表示。

1.2.4 鳳尾草對小鼠腹腔通透性試驗 取健康小鼠32只，均為雄性，體質量為（25±2.5）g，隨機分為模型組、陽性對照組和鳳尾草高、低劑量組四組，每組8只小鼠，分兩籠飼養，每籠各4只，分別做好標記（分別按左上/右上/尾/不標記進行區分），灌胃前記下每組每只小鼠的體質量。其中鳳尾草高、低劑量組分別以5 g/kg、2.5 g/kg劑量，按0.1 mL/10 g灌胃稀釋好的藥液，陽性對照組以0.2 g/kg劑量灌胃阿司匹林混懸液，模型組小鼠按0.1 mL/10 g灌胃生理鹽水。連續給藥5 d。每只小鼠給藥1 h后按0.2 mL/只尾靜脈注射0.5%伊文思藍生理鹽水溶液，尾靜脈注射不成功者宜舍棄。尾靜脈注射完立即按0.1 mL/10 g腹腔注射0.7%醋酸生理鹽水溶液，20 min后脫頸椎處死小鼠，處死小鼠腹腔注射3 mL生理鹽水，并輕輕按揉腹部，對腹腔進行充分洗滌，后小心將腹部皮膚肌肉剪開一個小口，用鑷子小心夾緊提起腹壁肌肉，以1 mL注射器小心多次吸取洗滌液，合并后3 000 r/min進行離心15 min，取上清液（必要時生理鹽水進行稀釋后）用雙光束紫外可見分光光度計于590 nm處測每只小鼠腹腔洗滌液的OD值。得到各組小鼠腹腔洗滌液的OD值后，SPSS17.0進行分析，組間獨立樣本t檢驗分析差異性，以表示。

1.3 鳳尾草對蓖麻油所致小鼠腹瀉的影響

1.3.1 隨機分組與給藥 取健康小鼠60只，體質量18～22 g，雌雄各半，隨機分為正常對照組、模型組、鳳尾草高、低劑量組4組，每組各10只，雌雄各5只，雌雄分籠飼養，試驗過程中做好標記（分別以左上/右上/左下/右下/尾/不標記進行區分）。正常對照組和模型組小鼠按0.1 mL/10 g灌胃生理鹽水，鳳尾草乙醇提取物高劑量組以5 g/kg、低劑量組以2.5 g/kg按0.1 mL/10 g灌胃稀釋好的藥，連續給藥3 d，每次給藥前、后均各禁食禁水2 h，末次給藥后30 min，除正常對照組給予同體積生理鹽水外，各組均以0.2 mL/只灌胃蓖麻油，試驗中給予藥液與給予蓖麻油的灌胃針完全區分開，給予蓖麻油的灌胃針每次用完用紙拭干，并多次沸水浸泡。而后將小鼠反罩在燒杯下，燒杯下鋪濾紙片，觀察5 h，每隔30 min更換濾紙一次。觀察各組小鼠體態皮毛、精神狀態、行為變化、大便等的變化。試驗中所得數據應用SPSS17.0做數據處理，進行組間獨立樣本t檢驗，以表示。

1.3.2 觀察指標 （1）每小時腹瀉發生率和總腹瀉率。每小時腹瀉發生率：每組小鼠每小時內的腹瀉只數與該組小鼠總只數之比。總腹瀉率：每組小鼠在觀察時間內腹瀉只數與該組小鼠總只數之比。

（2）稀便次數、干便次數、總便次數[10]：以濾紙上每?；蛎慷眩ㄖ覆荒芊智辶嫡撸┘S便為排便一次；干便不黏連成顆粒狀；稀便多不成形，含水量大，內有黏性液體；總便次數為干便次與稀便次數之和數。

（3）稀便率與稀便級、平均稀便級與腹瀉指數。平均稀便率：每只小鼠在觀察時間內排總稀便次數與總排便次數之比，并求出該組小鼠的平均稀便率。稀便級：表示每只小鼠排稀便的程度，以稀便污染濾紙形成的污跡的直徑（cm）大小定級，分為四級，分級標準見表1。污跡為圓形較規則的測其直徑；不規則形狀則測量其最長和近似圓的直徑，兩數相加除以2[11]。

表1 稀便級數與污跡直徑對照表Tab.1 Comparison table of loose stool grade and diameter of stain

平均稀便級：統計時先逐個測量每只小鼠每一堆稀便的級數，然后將該只小鼠在觀察時間內所有的稀便級數相加，除以排稀便次數得每只小鼠稀便的平均級數，最后求出該組小鼠的平均稀便級。

腹瀉指數：為稀便級與稀便率的乘積。

（4）稀便抑制率：（模型組每小時的平均稀便數－其余組每小時的平均稀便數）/模型組每小時的平均稀便數×100%

2 結果與分析

2.1 鳳尾草對正常小鼠小腸推進和胃排空的影響

正常小鼠的小腸推進作用試驗是研究中藥抗腹瀉機理常用的方法之一。表2的數據顯示，鳳尾草提取物對正常小鼠胃排空和小腸推進的影響，雌雄小鼠之間有一定的差異。對于雌性小鼠，與正常小鼠相比，鳳尾草提取物高、低劑量組均能提高半固體糊胃內殘留率及抑制小腸蠕動，5 g/kg的鳳尾草乙醇提取物連續給藥3 d能顯著（P<0.05）提高胃內殘留率，表明其有抑制正常雌性小鼠胃排空的作用，并且能極顯著（P<0.01）抑制小腸蠕動；對于雄性小鼠，與正常小鼠相比，鳳尾草提取物高、低劑量組均能降低半固體糊胃內殘留率及促進小腸蠕動，5 g/kg的鳳尾草提取物連續給藥3 d能顯著（P<0.05）降低胃內殘留率，表明其有促進正常雄性小鼠胃排空作用，并且能顯著（P<0.05）抑制小腸推進。

表2 鳳尾草對正常小鼠小腸推進運動及胃排空的影響（n=12，）Tab.2 Effect of Pteris multifda Poir.on small intestine propulsion and gastric emptying in normal mice

表2 鳳尾草對正常小鼠小腸推進運動及胃排空的影響（n=12，）Tab.2 Effect of Pteris multifda Poir.on small intestine propulsion and gastric emptying in normal mice

“a”表示與模型組相比差異顯著（P<0.05），“A”表示差異極顯著（P<0.01）Compared with the model group，“a”means significant difference（P<0.05），“A”means extremely significant difference（P<0.01）

2.2 鳳尾草對多潘立酮負荷下的小鼠小腸推進作用

與正常對照組相比，雄性單純多潘立酮組小腸推進率顯著（P<0.05）升高，雌性小腸推進率有所增加，說明雄性胃腸亢進模型建立成功。對于雌性小鼠而言，與正常對照組、單純多潘立酮組相比，鳳尾草乙醇提取物小腸推進率均有所降低，但差異無統計學意義（P>0.05）；對于雄性小鼠而言，與單純多潘立酮組相比，鳳尾草乙醇提取物小腸推進率均減小，鳳尾草能顯著（P<0.05）減緩小腸蠕動，表明鳳尾草乙醇提取物有拮抗多潘立酮，抑制雄性小鼠小腸蠕動的作用。結果見表3。

表3 鳳尾草對多潘立酮負荷下的小鼠腸推進的影響（n=10，）Tab.3 Effect of ethanol extract of Pteris multifda Poir.on intestinal propulsion of mice under the loading of domperidone

表3 鳳尾草對多潘立酮負荷下的小鼠腸推進的影響（n=10，）Tab.3 Effect of ethanol extract of Pteris multifda Poir.on intestinal propulsion of mice under the loading of domperidone

與正常對照組相比，“a”表示差異顯著（P<0.05）；與單純多潘立酮組相比，“b”表示差異顯著Compared with the normal control group，“a”means significant difference（P<0.05）；Compared with the simple domperidone group，“b”means significant difference

多潘立酮是目前臨床上應用較廣泛的促進胃腸動力藥，該藥進入動物體內，不通過血腦屏障，直接作用于消化系統，促使胃腸道的平滑肌出現緊張性收縮，從而促進胃排空和小腸的蠕動。本試驗通過給予小鼠多潘立酮的前提下研究鳳尾草對小腸推進作用的影響，5 g/kg鳳尾草乙醇提取物能明顯降低雄性小鼠小腸推進率，雌性小鼠作用不顯著，表明鳳尾草具有拮抗胃腸平滑肌緊張性收縮的興奮功能，具有調節胃腸運動的作用，使得腸道恢復節律性的運動，為探究鳳尾草的抗腹瀉機理研究奠定了基礎。

2.3 鳳尾草對小鼠腹腔通透性的影響

與模型組相比，鳳尾草高、低劑量組與阿司匹林組均能降低小鼠腹腔毛細血管通透性，鳳尾草提取物高劑量組作用更強。5 g/kg鳳尾草乙醇提取物與模型組差異極顯著（P<0.01），抑制率達37.327%。由此可見，5 g/kg的鳳尾草乙醇提取物的抗炎活性較好。結果見表4。

表4 鳳尾草對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響（n=8，）Tab.4 The effect of Pteris multifda Poir.on the permeability of capillaries in the abdominal cavity of mice

表4 鳳尾草對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響（n=8，）Tab.4 The effect of Pteris multifda Poir.on the permeability of capillaries in the abdominal cavity of mice

與正常對照組相比，“A”表示差異極顯著（P<0.01）Compared with the normal control group，“A”means extremely significant difference（P<0.01）

醋酸致小鼠腹腔毛細血管的增高試驗是常用的抗炎性滲出典型的模型之一。本研究顯示，5 g/kg、2.5 g/kg鳳尾草乙醇提取物均能抑制冰醋酸所致小鼠腹腔毛細血管的增高，5 g/kg作用極顯著，說明鳳尾草乙醇提取物在一定濃度下極顯著抑制小鼠腹腔的急性炎性滲出。而選用的阿司匹林腸溶片作為陽性對照藥，抑制率為30.415%。近年來，黃酮類化合物作為多數中藥的主要成分，其體內抗炎作用已有研究。崔偉等[12]發現甘青虎耳草總黃酮能明顯抑制冰醋酸引起的小鼠腹腔毛細血管通透性增強，并且能有效抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹；天山堇菜總黃酮在0.08 g/kg、0.16 g/kg、0.32 g/kg可顯著抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管炎性滲出，在0.16 g/kg、0.32 g/kg可顯著抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹[13]；說明可能是鳳尾草中的黃酮類化合物發揮了抗炎作用。另外，吳立夫等[14]研究了苦參和風輪萊對醋酸所致的兔腸黏膜毛細血管通透性增加的影響極顯著，來推測其對急性腸炎的作用。

2.4 鳳尾草對蓖麻油所致小鼠腹瀉的影響

除正常對照組外，各組灌胃蓖麻油一段時間后，均表現出一定程度的腹瀉狀況，腹瀉小鼠表現為精神沉郁，倦怠乏力，毛發粗糙，眼周圍有分泌物，不易睜開，排稀便次數有所增加，糞便較正常小鼠糞便偏黃褐色，無固定形狀，糞便含水量增加，內有粘稠性液體，固體內容物較少，表明模型建立成功。

對于0～5 h內每小時的稀便數，除正常對照組外，各組灌胃蓖麻油均出現拉稀便，模型組在0～3 h內拉稀程度隨著時間而加重，鳳尾草高、低劑量組在0～1 h稀便數量與模型組相當，在1～2 h比模型組嚴重，但在2～5 h稀便數遠低于模型組，說明鳳尾草的止瀉起效時間在2 h。對于每小時的腹瀉發生率，與模型組相比，鳳尾草高、低劑量組0～5 h內的腹瀉發生率均降低，高劑量組差異顯著（P<0.05），說明鳳尾草發揮止瀉療效的時間主要在2～5 h。對于稀便抑制率，鳳尾草高劑量組在0～4 h達到最大值26.415%，說明5 g/kg鳳尾草在4 h時抑制小鼠腹瀉作用最強。對于0～5 h的總腹瀉率，除正常組外，鳳尾草高劑量組在0～1 h、0～2 h、0～3 h、0～4 h的總腹瀉率遠低于模型組，說明5 g/kg鳳尾草發揮止瀉療效有較好的效果且持續時間久。與模型組相比，鳳尾草高劑量組在0～2 h的平均稀便級顯著降低（P<0.05），0～3 h、0～4 h極顯著降低（P<0.01），平均稀便率和平均腹瀉指數相對降低，說明5 g/kg鳳尾草在2～4 h的止瀉療效最顯著。表明對于蓖麻油致小鼠腹瀉模型試驗中，鳳尾草乙醇提取物有較好的止瀉作用，鳳尾草提取物高劑量組療效比低劑量組好。結果見表5。

表5 鳳尾草乙醇提取物對蓖麻油所致小鼠腹瀉的影響（n=10，）Tab.5 Effect of ethanol extract of Pteris multifda Poir. on diarrhea induced by castor oil in mice

表5 鳳尾草乙醇提取物對蓖麻油所致小鼠腹瀉的影響（n=10，）Tab.5 Effect of ethanol extract of Pteris multifda Poir. on diarrhea induced by castor oil in mice

“a”表示差異顯著（P<0.05），“A”表示差異極顯著（P<0.01）Compared with the model group，“a”means significant difference（P<0.05），“a”means extremely significant difference（P<0.01）

蓖麻油與番瀉葉、硫酸鎂、大黃等是致小鼠腹瀉模型的常用藥物，是研究中藥抗腹瀉機理常見的方法。蓖麻油屬于刺激性瀉藥，是能夠刺激小腸黏膜的致瀉劑。蓖麻油于小腸上部被脂肪水解酶水解成蓖麻醇酸，腸道平滑肌被水解產生的蓖麻醇酸刺激，而損害腸粘膜細胞并引起炎癥，使得腸蠕動加快，抑制了水和電解質的吸收，進而出現滲出性的腹瀉[15]。選用蓖麻油做誘導小鼠小腸腹瀉，是通過促進炎性因子的合成和釋放，刺激膜整合蛋白，引起細胞進行信號應答，增大腸液的分泌量以至于超過腸道的重吸收能力來造成的。

鳳尾草具有抗滲出性腹瀉的作用，其主要成分黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗氧化作用，作為鳳尾草的物質基礎，可能是通過抗炎作用對抗炎癥介質的致瀉作用而發揮著抗腹瀉效果。

3 討論

隨著全球新冠肺炎的爆發，中藥在全世界范圍內受到廣泛認可。中藥發揮作用的整體性、成分的可變性及之間相互作用的難以預測性、作用靶點的復雜性等，已成為研究中藥抗腹瀉機制的難點。目前許多研究者對中藥抗腹瀉作用機制進行研究，發現中藥的抗菌、抗腹瀉密切相關，多方位發揮作用。

采用醋酸致小鼠腹腔膜毛細血管通透性增大的模型考察中藥抗炎作用，由腹腔滲透液中生物染料伊文思藍的含量差異反應中藥作用后毛細血管通透性的不同。炎癥介質是一類致瀉性自體活性物質，臨床所見的大多數瀉藥和腹瀉性疾病均是致病因子使腸道發生炎癥，從而釋放各種炎性介質如花生四烯酸、前列腺素和組胺等，導致動、靜脈擴張，增加血管滲透壓，引起體液和血漿蛋白的滲出。因此，藥物可以通過抗炎過程來達到止瀉效果。本文中鳳尾草提取物能抑制急性炎性滲出作用，可能是抑制液體從腸壁向腸腔的滲出而抑制急性腸炎的滲出。

蓖麻油致小鼠腹瀉模型及小鼠小腸推進試驗是探究中藥抗腹瀉機理常用的方法。寄生于腸道內的致病性大腸桿菌是引起畜禽腹瀉的一大原因。大腸桿菌在小腸內定殖，其黏附作用借助于菌毛黏附素和靶細胞表面相應的受體，產生腸毒素，破壞小腸內水和電解質的正常吸收和排泄的動態平衡，而引起劇烈腹瀉。患大腸桿菌病的畜禽常伴發急性腸炎，主要病變在小腸，與蓖麻油作用部位一致，蓖麻油通過促進炎性介質的釋放致炎、致腹瀉。鳳尾草抗蓖麻油引起的腹瀉有很好的止瀉效果，為研究其對實驗性大腸桿菌腹瀉的藥效試驗提供了理論基礎。