飼料銅水平對黃鱔肝臟生化指標及肝臟、腸道組織結構的影響

王 穎 ，劉 瑜，高 淼，姜文灝，隗黎麗，王自蕊，周秋白*

（1.江西農業大學動物科學技術學院，江西南昌 330045；2.廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524088）

【研究意義】銅通過參與構成含銅酶及蛋白在機體內發揮多種重要的生理功能，是魚類所必需的微量營養元素之一。銅作為重金屬元素，除具備營養作用外還具有較強的毒性，過量銅可通過芬頓反應產生大量自由基，進而造成蛋白質、脂質過氧化及DNA損傷[1]。腸道和肝臟是魚類吸收利用飼料營養元素的主要器官，飼料營養組成的差異可造成魚類消化器官結構及功能發生改變[2]。【前人研究進展】據報道，中間銅水平（3.75 mg/kg、5.25 mg/kg）飼料能夠提升草魚（Ctenopharyngodon idelus）肝胰腺抗氧化性能、保護肝胰腺，而當飼糧銅水平高于5.25 mg/kg時，草魚肝胰腺抗氧化性能降低[3]。吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）肝臟中SOD和CuZn?SOD的活性隨飼料銅水平的提高表現出先升高后降低的趨勢，并且銅的添加量超過300 mg/kg會使其肝胰腺等組織結構和功能損傷[4]。當飼料中銅濃度≥506.9 mg/kg時，異育銀鯽（Carassiusauratus gibelio）和斑點叉尾鮰（Ietalurus punetaus）的肝臟與對照組相比內質網有擴張的現象[5]。【本研究切入點】黃鱔（Monopterus albus）是我國重要的水產養殖品種[6]，其營養需求研究已取得諸多成果[7?8]，但飼料銅對黃鱔肝臟、腸道結構和功能的影響目前未見報道。【擬解決的關鍵問題】本試驗以黃鱔為對象，以攝食不同銅水平飼料黃鱔的肝臟生化指標及肝臟、腸道組織結構的變化來探究飼料銅對黃鱔組織的影響，以期為不同銅水平飼料對黃鱔組織的影響提供理論依據，為飼料中銅添加量的確定提供有用的信息。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及材料

于江西農業大學水產養殖基地挑選體質健康、無病無傷、活力較佳，均質量為（62.09±1.07）g的黃鱔用作試驗，共600尾。試驗共分為5組，每組4個重復，每個重復放置黃鱔30尾。養殖箱為88 cm×66 cm×64 cm藍色塑料箱，在養殖箱內放置水葫蘆，試驗開始前7 d消毒，養殖用水為曝氣自來水。試驗采用分析純五水硫酸銅（CuSO4·5H2O，西隴科學股份有限公司）作為飼料銅源，其余飼料原料購置于江西大佑農生物科技有限公司。試驗飼料采用相同的營養配方及原料制備，所有原料均粉碎過80目。為使試驗飼料銅水平涵蓋低銅至高銅，以等對數間距（Log10）設計飼料銅添加梯度，在基礎飼料中分別添加0，10，36.8，135.7，500 mg/kg含量的Cu2+，5組（CL1、CL2、CL3、CL4、CL5）飼料Cu2+實測值分別為14.21，23.95，37.01，135.63，499.63 mg/kg。制粒時先將五水硫酸銅加入預混合飼料充分混勻，在逐級混勻所有原料后調質制粒。試驗飼料原料組成及營養成分見表1。

表1 試驗飼料原料組成及營養水平（干物質）Tab.1 Raw material composition and nutrient levels of experimental feed（DM basis）

1.2 養殖管理

試驗養殖工作在江西農業大學水產養殖基地進行，養殖試驗期共60 d。正式試驗開始前，暫養3周并飼喂對照組飼料進行訓食。養殖期間，每2～3 d換水1/2，以保證養殖水質良好（pH=7.6±0.5；溶解氧>6.0 mg/L；NH4+?N<0.3 mg/L；NO2??N<0.1 mg/L），自然水溫（21～30 ℃），使水葫蘆覆蓋2/3水面。每日18:00投餌一次，每次投餌將飼料投置于同一位置，先投喂部分飼料，根據黃鱔吃食狀況酌情補料，使飼料全部吃完。

1.3 樣品采集

試驗取樣前停食1 d，對每個養殖箱黃鱔進行稱量計數，生長數據見表2。采用60 mg/L的MS222麻醉10 min，每箱隨機選取3尾黃鱔進行采血，以保證血液盡可能少的殘存在內臟中，隨后在無菌工作臺上低溫解剖。其中2尾取肝臟、腸道組織浸泡于4%多聚甲醛溶液（賽維爾），24 h換液一次，用于制備HE染色切片；并取肝組織浸泡于2.5%戊二醛溶液（賽維爾），24 h換液一次，4 ℃放置備用，用于制備肝臟透射電鏡切片。剩余1尾取肝組織樣品，將樣品放置于無菌1.5 mL EP管中，液氮速凍后轉移至?80 ℃超低溫冰箱保存，用于測定肝臟生化指標。

表2 飼料銅水平對黃鱔生長性能的影響Tab.2 Effect of dietary copper level on growth performance of Swamp eels

1.4 測定方法

飼料中銅含量測定方法參照GB 5009.13—2017中第二法（火焰原子吸收光譜法），采用濕法消解進行樣品前處理，原子吸收器型號為TAS?990A（北京普析通用儀器有限責任公司）。肝、腸經4%多聚甲醛固定后，脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟、染色、乙醇梯度脫水透明和封固來完成HE切片的制備，肝經2.5%戊二醛溶液固定后，漂洗、鋨酸固定、再漂洗、乙醇梯度脫水、滲透、包埋、超薄切片和正染色來完成投射電鏡切片的制備，HE染色切片及肝組織透射電鏡切片均送至武漢塞維爾生物科技有限公司完成制備。肝組織生化指標測定試劑盒購置于南京建成生物工程研究所，嚴格按照試劑盒的說明書對丙二醛（MDA）含量（TBA法），超氧化物歧化酶（T?SOD）（WST?1法）、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu?ZnSOD）（羥胺法）、過氧化氫酶（CAT）活力（可見光法）及乳酸脫氫酶（LDH）（微板法）活力進行測定，高速組織研磨儀（武漢塞維爾，KZ?II）、分光光度計（上海箐華，755B型）、酶標儀（賽默飛）、恒溫水浴箱（鄭州市亞榮儀器有限公司HH?ZK4）、高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司3H20RI型）、恒溫干燥箱（金壇市宏華儀器廠101A?3型）、漩渦混勻儀（海門市其林貝爾，XW?80A）和微量移液器等為主要使用儀器。

1.5 數據分析

結果采用平均值±標準誤（Mean±SE）表示，用SPSS 22.0進行單因素方差分析（one?way ANOVA），若組間差異顯著，再用Duncan’s進行多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 試驗結果

2.1 飼料銅水平對黃鱔肝臟抗氧化能力的影響

飼料銅水平對黃鱔肝臟生化指標的影響如表3所示。CL3、CL4、CL5組SOD、Cu?ZnSOD活力顯著高于CL1、CL2組（P<0.05）；CL4、CL5組LDH活力及MDA含量顯著高于CL1、CL2、CL3組（P<0.05）；各組黃鱔肝臟CAT活力則無顯著差異（P>0.05）。

表3 飼料銅水平對黃鱔肝臟抗氧化的影響Tab.3 Effect of dietary copper level on liver biochemical indexes of Swamp eels

2.2 飼料銅水平對黃鱔肝臟顯微結構和超顯微結構的影響

飼料銅水平對黃鱔肝臟顯微結構的影響如圖1所示。5組黃鱔肝臟均存在不同程度損傷，其中CL1、CL2、CL3組肝臟結構相對于CL4、CL5組更為完善，表現為：肝小葉結構明顯，肝細胞間界限更為清晰、核仁明顯，細胞核大多分布在細胞中心區域。CL4、CL5組肝臟細胞分布散亂、細胞間限不清晰，肝細胞腫脹、細胞核偏移，出現大量無核肝細胞，伴有肝細胞空泡、破裂現象。

圖1 飼料銅水平對黃鱔肝臟顯微結構的影響，H E染色，放大倍數×400Fig.1 Effects of dietary copper level on liver microstructure of Swamp eels，H E staining，magnification×400

飼料銅水平對黃鱔肝臟超微結構的影響如圖2所示。CL1、CL2、CL3 3組黃鱔肝臟細胞結構較為完善，核膜完整、清晰可見；細胞核周圍分布有大量結構完整的粗面內質網，并以片層狀排列；細胞核與內質網周邊分布有不同數量結構完整的線粒體，其中CL3銅水平組線粒體數量最多；溶酶體數量及大小相對正常。CL4組內質網呈斷裂不連續狀態游離分布在細胞核外側；溶酶體體積增大、數量增加，內部可見被吞噬的細胞器，CL5組內質網卷曲破裂、分布散亂，線粒體腫脹破碎，細胞質基質中可見大量脂滴。

圖2 飼料銅水平對黃鱔肝臟超微結構的影響Fig.2 Effect of dietary copper level on liver ultrastructure of Swamp eels

2.3 飼料銅水平對黃鱔腸道顯微結構的影響

飼料銅水平對黃鱔腸道顯微結構的影響如圖3所示。各組黃鱔腸絨毛均存在一定程度損傷，表現為腸絨毛披膜受損不平，絨毛內結締組織分離；其中以CL5組黃鱔腸絨毛內結締組織分離情況最為嚴重。CL1、CL2、CL3組腸絨毛杯狀細胞數量相對穩定，CL4、CL5組腸絨毛杯狀細胞數量急劇增加。

圖3 飼料銅水平對黃鱔腸道顯微結構的影響，H E染色，放大倍數×400Fig.3 Effects of dietary copper level on intestinal microstructure of Swamp eels，H E staining，magnification×400

3 討論與分析

3.1 飼料銅水平對黃鱔肝臟生化指標的影響

與肝臟氧化損傷相關指標的變化可用于衡量魚類受飼料重金屬脅迫程度[9]。SOD是機體抗氧化系統重要組成，其通過歧化反應高效的消除超氧自由基，進而避免機體氧化損傷[10]。SOD為金屬酶，可根據輔基和分布區域的不同而分為：Cu?Zn SOD、Mn SOD及胞外SOD（EC?SOD）[11]，并以Cu?Zn SOD為主要類型。本試驗中，黃鱔肝臟Cu?Zn SOD、T?SOD活力在CL3組開始顯著上升，表明攝入充足的銅元素能夠促進黃鱔肝臟抗氧化能力提升。銅是Cu?Zn SOD主要構成元素之一，銅元素攝入不足可導致Cu?Zn SOD合成受阻，這可能是本試驗中CL1、CL2組黃鱔肝臟抗氧化能力更低的原因[12]。同樣，在俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）[12]、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[13]和斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[14]的研究上也發現，飼料中補充銅能夠提升肝臟Cu?Zn SOD和T?SOD活力。

MDA是生物膜過氧化產物之一，能夠與脂類、蛋白質及核酸等生物大分子交聯進而破壞細胞膜結構[4]，其含量高低可有效反映細胞脂質過氧化程度[15]。本試驗中，高銅組（CL4、CL5）組MDA含量顯著升高，表明高銅飼料會加重肝臟氧化損傷程度。與本試驗結果類似，吉富羅非魚在攝食銅水平低于300 mg/kg的飼料時肝臟MDA含量無顯著變化，當飼料銅水平達到1 057.29 mg/kg時肝臟MDA含量顯著上升[4]。

LDH是糖代謝過程中的關鍵酶，參與丙酮酸與乳酸的轉變過程，一般存在于細胞基質中，能夠在一定程度上反映機體能量代謝狀況[16]。研究表明，Cu2+與能量代謝過程密切相關。李艷純等[17]認為細胞內Cu2+過量可抑制線粒體內鐵硫簇的組裝，造成鐵硫蛋白功能損傷，從而影響三羧酸循環及氧化磷酸化過程，最終造成線粒體能量代謝的異常。Bottje等[18]及Iqbal等[19]認為Cu2+因芬頓反應產生的自由基會造成線粒體內膜脂蛋白和DNA嚴重損傷，引起線粒體功能受阻，無法合成充足的ATP用以自身修復或再生，損傷線粒體呼吸鏈功能。本試驗中，高銅組黃鱔肝臟LDH活力顯著上升，表明高銅飼料脅迫下黃鱔肝臟能量代謝方式發生改變。

3.2 飼料銅水平對黃鱔肝臟顯微結構和超顯微結構的影響

肝臟是魚類主要的營養代謝器官及解毒器官，飼料銅水平與肝臟組織結構與功能密切相關。崔欣[4]研究發現高銅飼料造成吉富羅非魚肝臟脂肪變性，最終導致肝細胞腫脹、細胞膜界限模糊；種香玉[5]研究發現高銅飼料引起異育銀鯽和斑點叉尾鮰肝細胞內質網擴張、線粒體腫脹凋亡。本試驗中，低銅組黃鱔肝臟損傷程度小、細胞器結構清晰完整，高銅組黃鱔肝臟損傷嚴重、細胞器結構破碎，大量肝細胞溶解死亡，表明高銅飼料可造成黃鱔肝臟損傷。這可能是銅在肝臟中過度蓄積，產生大量自由基引起細胞生物膜脂質過氧化所導致。

銅在脂代謝過程中具有改性劑的作用，與魚類脂肪代謝及沉積關系密切[20]。宋玉峰[20]研究發現高銅飼料會誘導黃顙魚體內發生內質網應激（ER Stress），進而引起脂類代謝基因表達下調，導致脂類在細胞內沉積，這可能是本試驗中CL5組肝細胞內脂滴大量沉積的原因。

3.3 飼料銅水平對黃鱔腸道顯微結構的影響

腸道是魚類對飼料營養成分進行消化吸收的主要器官，飼料營養與動物腸道的結構、腸黏膜的生長修復及生理功能密切相關[21]。種香玉[5]研究發現，高銅（1 491.1 mg/kg）飼料造成異育銀鯽和斑點叉尾鮰腸絨毛排布凌亂、柱狀細胞空隙增大。本試驗中，高銅組黃鱔腸絨毛損傷更為嚴重，并伴有腸絨毛杯狀細胞數量急劇增加，表明高銅飼料會造成黃鱔腸道結構及功能受損。研究表明，腸道有助于緩沖魚類對飼料銅的吸收[22?23]，杯狀細胞分泌黏液蛋白所構成的腸黏液屏障對腸道具有保護作用[24]。Handy等[25]研究發現黏液覆蓋在腸道表面能夠將游離Cu2+絡合成藍色沉淀，進而降低銅對腸道損傷；其將腸囊外翻放置于不同銅濃度的生理鹽水培養基中，發現增加銅濃度能夠刺激腸囊分泌黏液。此外，腸粘膜受損時杯狀細胞分泌的三葉狀蛋白能夠促進受損上皮細胞修復[26]。因此在本試驗中，黃鱔腸道黏液細胞數量增加可能是黃鱔對高銅飼料的一種防御及自身修復機制。黃鱔在機體攝入銅過量時為降低腸道對銅的吸收，通過增加杯狀細胞數量來提升黏液分泌量，進而提升對飼料銅的屏障能力。

4 結論

在基礎飼料中添加適量銅能提升黃鱔肝臟抗氧化能力，但添加過量銅會加重肝臟脂質過氧化程度。在高銅飼料的脅迫下，黃鱔可通過增加腸絨毛杯狀細胞數量方式促進腸黏液分泌，從而增強對飼料銅的屏障能力。但這種屏障能力有限，高銅飼料可導致黃鱔肝臟結構受損，肝細胞線粒體及內質網破碎凋亡。