烏骨雞腸乳桿菌的分離鑒定及體外抑菌試驗

劉小蘭，鄧舜洲，康紹珠，曹 剛，高 蕊，劉可心，鐘霆霆，黃靖文，朱芝秀

（江西農業大學動物科學技術學院，江西南昌 330045）

【研究意義】20世紀40年代以來，在飼料工業及養殖業生產中，抗生素飼料添加起到了不容置疑的重大作用[1]。然而，長期使用抗生素所引起的藥物殘留及毒害作用又給人類的健康帶來了潛在的威脅[2]。因而尋找一種無殘留、無毒害、無耐藥性的飼料添加劑來替代抗生素用于畜牧業生產便愈來愈受到重視[3]。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指一群可發酵碳水化合物、發酵時產生大量乳酸的革蘭氏陽性球菌或桿菌的統稱[4]。乳酸菌是定居在腸道中的一類有益菌群，在健康人畜的腸道中，各種細菌的種類、數量和定居部位是相對穩定的，它們相互協調，互相制約，共同形成一個微生態系統[5]。乳酸菌作為微生態飼料添加劑在畜牧行業中的應用越來越廣泛，其具有安全、綠色、無污染、無殘留等特性，是抗生素的理想替代品[6]。【前人研究進展】乳酸菌具有抗氧化、抑菌、耐藥性等作用。梁曉明等[7]試驗發現副干酪乳酸菌產生的有機酸對致病弧菌有顯著的抑制作用。朱建寧等[8]從牦牛中分離出的乳酸菌能抑制大腸桿菌的生長。李宏偉等[9]從烏骨雞腸道內容物中分離到植物乳桿菌菌株、短乳桿菌菌株對豬霍亂沙門氏菌有明顯的抑制作用。Yang等[10]飼喂了乳酸菌飼料的仔豬腹瀉率顯著降低，證明了乳酸菌作為益生菌的實用性。高暢等[11]通過研究發現富硒乳酸菌中藥制劑可以大大提高育肥豬免疫能力和血清及組織的抗氧化能力。乳酸菌還具有改善動物的腸道健康、提高肉品質的作用。Wang等[12]在日糧中添加微囊化植物乳桿菌（MLP）和低聚果糖（FOS）組成的合生素，提高豬的平均日增重和平均日采食量。Lojanica等[13]給斷奶仔豬口服干酪乳桿菌和糞腸球菌等的復合制劑，結果表明仔豬平均日增重顯著增加。Genis等[14]給產犢前奶牛的陰道內注射兩次乳酸菌后，子宮炎患病率降低至58%。Zhang等[15]報道，在日糧中添加微囊化乳酸菌可顯著提高肉雞生長性能和免疫功能，并且可以改善盲腸微生物群落，調整肉雞的健康狀況。【本研究切入點】為了獲得益生效果良好的優勢乳酸菌，本試驗通過對烏骨雞腸道黏膜組織進行細菌分離及體外抑菌試驗，旨在尋找能在禽類生產實踐中替代抗生素的乳酸菌，提高烏骨雞生產性能，減少抗生素的使用率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 烏骨雞：體質量1.5～2.0 kg，由南昌烏骨雞養殖場提供；試驗小白鼠：健康雄性6周齡的BALB/c小白鼠，體質量18～22 g，由南昌大學醫學院動物試驗中心提供。

1.1.2 病原菌 大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌等病原指示菌由江西農業大學動科院預防獸醫教研室保存。

1.1.3 主要儀器 COCI光學顯微鏡，購自重慶光學儀器廠公司；立式自動電熱蒸氣滅菌器，購自上海申安醫療器械廠公司；電熱恒溫培養箱，購自上海躍進科學儀器廠公司；PCR儀、電泳儀，購自Bio?Rad公司。

1.1.4 主要試劑 MRS培養基、伊紅美藍培養基、麥康凱培養基、革蘭氏染色劑，均為自行配制；藥敏紙片、微量生化發酵管，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離鑒定 （1）細菌的分離培養與純化。樣品的采集與處理：將健康烏骨雞解剖，取出其腸道，用生理鹽水沖洗腸道，刮取小腸黏膜組織，取1 g黏膜組織加5.0 mL生理鹽水制作組織懸浮液。細菌的分離培養與純化：取組織懸浮液至MRS液體試管（100μL/支），37 ℃擴增培養24 h后，10倍遞減稀釋至10?6，挑選10?4、10?5稀釋液涂抹改良MRS固體培養基，37 ℃搖床振蕩（200 r/min）培養24 h，挑取有溶鈣圈的菌株革蘭氏染色鏡檢，再次劃線接種純化，4 ℃保存備用。分離菌的生長特性：將分離菌接種MRS液體培養基，37 ℃搖床培養72 h，每隔12 h取樣2份；1份測定OD值（600 nm），以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線圖；另1份測定pH值，以時間為橫坐標，pH值為縱坐標，繪制pH值變化曲線圖。分離菌的產酸特性：將分離菌點種于溴甲酚紫蛋白胨培養基，置于37 ℃溫箱培養24 h，觀察菌落產酸圈的大小。分離菌對胃蛋白酶、豬膽鹽的耐受性：將分離菌接種到3組MRS液體培養基，37 ℃搖床培養24 h后，第一試驗組調整pH值為3后加入胃蛋白酶（5 mg/mL）處理，第二試驗組加入0.1%豬膽鹽處理，第三組為空白對照組，均放入37 ℃搖床繼續振蕩培養30 min后取出，按10倍梯減法稀釋至10?7，取1 mL稀釋液涂布于MRS固體培養基，37 ℃靜置培養24 h后，進行菌落計數，根據下式計算存活率：

分離菌的微量生化特性：參照文獻[16?17]，將分離菌分別接種阿拉伯糖、七葉苷等微量生化反應管中，37 ℃靜置培養24 h后，比對《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]與《常見細菌系統鑒定手冊》[19]，初步鑒定分離菌的種屬。

（2）分離菌16S rDNA分子生物學鑒定。挑取分離菌單個菌落于MRS液體培養基中，振蕩培養48 h，菌體經變性處理后，12 000 r/min，離心10 min，取上清液為模板，利用16S rDNA通用測序引物16S?F：5′?AGAGTTTGATCTGGCTCAG?3′，16S?R：5′?TACGGTACCTTGTTACGACTT?3′，進行PCR擴增[20]。PCR擴增體系：ddH2O 37.5 μL、10×TransTaqHiFi Buffer 5μL、dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL、DNA模版2.0 μL，TransTaqHiFi酶0.5μL、上游引物16S?F 0.5μL、下游引物16S?F 0.5μL，共50μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min。共35個循環，最后72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物在EB染色后的15 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測（96 v電壓下電泳30 min），取岀凝膠于凝膠成像系統觀察結果并拍照。將PCR產物送至湖南擎科生物技術有限公司測序，測序結果用美國國立生物技術信息中心（NCBI）的Blast進行序列在線比對分析，確定菌種名。

1.2.2 分離菌的體外抑菌試驗 （1）分離菌的藥敏試驗。依據瓊脂擴散法[21]對分離菌進行藥敏試驗。將分離菌培養液均勻涂抹于MRS固體培養基，用眼科鑷按梅花狀將試紙輕貼于其上，37 ℃培養24 h后，測量抑菌圈直徑。

（2）分離菌體外抑制試驗及影響因素。分離菌的抑菌譜：將分離菌分別接種MRS液體培養基，37 ℃搖床振蕩培養3 d。依據牛津杯法[22]評價分離菌的抑菌活力，分別進行大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌等病原指示菌的體外抑菌試驗。溫度對分離菌發酵液的影響：將WJ2?6發酵液分別于60，80，100 ℃下水浴20 min，再進行對金黃色葡萄球菌的體外抑制試驗。pH值對分離菌發酵液的影響：將WJ2?6發酵液pH值分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，再進行對金黃色葡萄球菌的體外抑制試驗。

蛋白酶對分離菌發酵液的影響：將WJ2?6發酵液中分別加入胃蛋白酶（每5 mL 0.2 g）和胰蛋白酶（每5 mL 0.2 g），水浴溫育2 h，設置空白WJ2?6發酵液為對照組，再進行對金黃色葡萄球菌的體外抑制試驗。

1.2.3 動物安全性試驗 將試驗小白鼠分為4組，每組5只，第4組為對照組。試驗組連續灌服對應的3株分離菌株，每只灌服0.5 mL，2次/日；對照組服喂等量的0.85%生理鹽水。觀察小鼠的狀態，試驗時間為2周。

2 結果分析

2.1 細菌的分離鑒定

2.1.1 細菌的分離培養與純化 分離純化得到3株菌株，分別編號為WJ2?1、WJ2?6、WJ2?7，分離菌在MRS固體培養基上菌落形態一致，呈圓形、微隆起、有明顯的溶鈣圈（圖1），革蘭氏染色鏡檢均為革蘭氏陽性單桿菌（圖2）。

圖1 分離菌菌落形態Fig.1 Morphology of isolated bacteria

圖2 分離菌染色鏡檢（10×100）Fig.2 Microscopic examination of isolates（10×100）

2.1.2 分離菌的生理、生化特性 分離菌的生長特性：分離菌生長曲線（圖3實線）所示，分離菌于6 h左右進入對數生長期；24～60 h進入穩定期。分離菌發酵液pH值變化情況（圖3虛線）：6～16 h發酵液pH值逐漸下降，24 h后處于穩定狀態。

分離菌的產酸特性：分離菌在溴甲酚紫蛋白胨培養基上形成黃色產酸圈（圖4），測得分離菌直徑大小分別是WJ2?1為18.74 nm、WJ2?6為20.39 nm、WJ2?7為20.33 nm。

圖3 WJ2?7生長曲線和pH值變化Fig.3 Growth curve and pH change of WJ 2?7

圖4 分離菌產酸圈Fig.4 Acid production circle of isolated bacteria

分離菌對胃蛋白酶、豬膽鹽的耐受性：分離菌經胃蛋白酶處理后，存活率=5.88×106/9.8×106=60%；分離菌經豬膽鹽處理后，存活率=2.058×106/9.8×106=21%。

分離菌的微量生化特性：分離菌均能分解乳糖、蔗糖甘露糖、七葉苷等，不分解木糖、阿拉伯糖等。M?R試驗為陽性；精氨酸水解酶、精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、H2S、氧化酶、V?P等均為陰性（表1）。

表1 分離菌株的生理生化結果Tab.1 Physiological and biochemical results of isolated strains

2.1.3 分離菌16S rDNA分子生物學鑒定 PCR產物在15 g/L瓊脂凝膠上的電泳結果見圖5，WJ2?1、WJ2?6、WJ2?7與2株唾液乳桿菌陽性對照均擴增出約為1 500 bp大小的目的片段；擴增后的PCR產物送至湖南擎科生物技術有限公司測序，測序結果在NCBI數據庫比對，分離菌與唾液乳酸桿菌（Lactoba?cillus salivariusstrain）同源性最高（圖6）；從GenBank中挑選13株乳酸桿菌屬菌株，利用MEGA7.0軟件的Clustal W算法進行多序列比對并構建系統發育樹，結果見圖7。其中WJ2?1、WJ2?6、WJ2?7與菌株NR028725.2、NR112759.1親緣關系最近，與菌株NR112758.1、NR042442.1親緣關系最遠（圖7）。

圖5 分離菌16S rDNA擴增電泳圖Fig.5 Isolation bacteria 16S rDNA amplification electrophoresis

圖6 分離菌16S rDNA基因序列同源性圖Fig.6 16S rDNA gene sequence homology of isolates

圖7 分離菌16S rDNA基因系統發育樹Fig.7 Isolation strain 16S rDNA gene sequence phylogenetic tree

2.2 分離菌體外抑制試驗

2.2.1 分離菌藥敏試驗 分離菌對新生霉素等高度敏感，對諾氟沙星等耐藥（表2）。

表2 分離菌藥敏試驗結果Tab.2 Drug sensitivity test resultsmm

2.2.2 分離菌體外抑菌試驗及影響因素 分離菌抑菌譜：分離菌對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、巴氏桿菌等病原指示菌均具有較強的抑制作用，具體結果見表3，圖8～10。

表3 分離菌體外抑菌試驗結果Tab.3 In vitro antibacterial test results of isolated bacteriamm

圖8 大腸桿菌抑菌圈Fig.8 Bacteriostatic ring of Escherichia coli

圖9 葡萄球菌抑菌圈Fig.9 Bacteriostatic ring of Staphylococcus

圖10 嗜水氣單胞菌抑菌圈Fig.10 Bacteriostatic ring of Aeromonas hydrophila

溫度對分離菌發酵液的影響：隨著溫度的提高，分離菌發酵液抑菌活性變化不大（圖11）；pH值對分離菌發酵液的影響：分離菌發酵液有較強的抑菌活性，但隨著pH值增加至7時，分離菌發酵液抑菌活性下降至0（圖12）；蛋白酶對分離菌發酵液的影響：分離菌發酵液經胃蛋白酶、胰蛋白酶處理后，抑菌活性基本不變（圖13）。

圖11 分離菌發酵液耐熱性結果Fig.11 Heat resistance results of the fermentation broth of isolates

圖12 分離菌發酵液耐酸性結果Fig.12 Acid resistance results of the fermentation broth of isolates

圖13 分離菌發酵液酶穩定性結果Fig.13 Enzyme stability results of the fermentation broth of isolates

2.3 動物安全性試驗

4組小鼠均無一死亡，均采食正常，精神良好。說明分離到的3株唾液乳酸桿菌安全可靠。

3 討論

乳酸菌具有安全、提高動物生產性能、增強免疫力等益生特性，在生物體的腸道中，它作為優勢群體，能產生多種有機酸及代謝產物，能夠有效抑制病原菌的生長繁殖[23]，維護動物的健康。從動物腸道中分離篩選乳酸菌是一個較佳選擇[24]，本試驗從烏骨雞腸道黏膜分離到3株乳酸菌，分離菌的菌落形態與楊紅亞等[25?27][報道一致；生化試驗結果，與楊俊俊[28]和孔璨等[29]報道的發酵葡萄糖等，不發酵木糖、阿拉伯糖等結果基本一致。經16S rDNA基因序列比對，與唾液乳酸桿菌的同源性最高，相似性高達99%，經序列系統進化樹分析可得分離菌WJ2?1、WJ2?6、WJ2?7與唾液乳酸菌株NR028725.2、NR112759.1的親緣關系最近。綜合分離菌的培養染色形態，生理生化特性與基因測序分析確定分離菌為唾液乳酸桿菌。

乳酸菌是一種能定植于動物機體胃腸道內，改善胃腸道內的微生態環境的益生菌，它可以通過調節宿主微生態平衡來達到益生的作用，在畜牧生產中有極高的應用前景，找到有獨特優勢的乳酸菌則極為重要。本試驗分離的乳酸菌生長迅速，溶蓋圈明顯，產酸能力強，在溴甲酚紫蛋白胨培養基上可以形成18～20 nm的黃色產酸圈。分離菌耐胃蛋白酶，有60%存活率，能抵御體外模擬的胃腸道逆環境的影響；分離菌抑菌譜廣，能抑制大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌、豬丹毒絲菌、巴氏桿菌等多種病原菌的生長，與劉小蘭等[30]和何軼群[31]報道一致；抑菌效果好，抑菌圈直徑較大，抑菌效果不受溫度、蛋白酶的影響，具備成為益生菌的優勢條件。分離菌可與諾氟沙星等藥物配合用藥，不可與頭孢曲松、新生霉素等藥物配合使用。分離菌灌喂小鼠均無一死亡，精神良好，確定分離到的3株唾液乳酸桿菌安全可用。