西瓜枯萎病生防細菌YZU-S8的篩選及其防病促生作用的研究

鄭通文，蔡民政，劉 璐，孫正祥，周 燚

（長江大學農學院/湖北省農林病蟲害預警與調控工程技術研究中心，湖北荊州 434025）

【研究意義】由尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporumf.sp.niveum，FON）侵染引起的西瓜枯萎病是一種世界性土傳病害，于1894年Smith首次報道，現已分布于世界各地的西瓜種植區[1?3]。該病害的病原孢子在土壤中可存活10年之久[4]，且寄主廣泛，給病害的控制帶來嚴重困難。目前防治西瓜枯萎病的方法主要有農業防治、抗病育種和化學防治[5]。農業防治簡單有效但費時費力；選育抗病品種周期長、難度大；化學農藥導致病菌產生抗藥性，且造成環境污染。利用植物有益生防菌進行生物防治既環保經濟又可持續，已經成為國內外學者研究的熱點。【前人研究進展】目前報道的西瓜枯萎病生防菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）和假單胞桿菌屬（Pseudomonasspp.）[6]，如：解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefa?ciens）[7?8]、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）[9]。【本研究切入點】這些菌株具有良好的室內防效，但其田間防效穩定性不理想，難以推廣應用[10]。因此，篩選更多更優質的生防資源具有重要的意義。【擬解決的關鍵問題】本研究從健康的油菜植株及根際分離篩選對西瓜枯萎病菌具有較強拮抗作用的細菌，測定其抑菌譜、盆栽防效和對西瓜植株的促生作用，以期為西瓜枯萎病的生物防治提供更多的菌源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試病原菌：西瓜枯萎病菌（FON）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄早疫病菌（Alternaria so?lani）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、白芨白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）和玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）均由本實驗室分離與保存，棉花黃萎病菌（Verticillium dahliaeKleb）由中國農業科學院棉花研究所惠贈。

西瓜品種：西農8號，由原西北農業大學科研人員選育。培育西瓜所用的基質土為長江大學農學院自行研發的育苗專用基質土。供試培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基（PDB）和營養肉湯培養基（NB）及相應的固體培養基[11]。

1.2 西瓜枯萎病拮抗菌株的分離純化

以五點取樣法，2019年從荊州12塊油菜田采集長勢良好的油菜植株，抖去根部大量土壤，用滅菌的毛刷輕輕刷下根際土（約0.5 mm厚度），將油菜植株和根際土分別裝在采樣袋中帶回實驗室，備用。根際細菌的分離：取10 g根際土，加入90 mL無菌水懸浮，獲得10?1稀釋液，依次梯度稀釋，取適量的10?7，10?8，10?9稀釋液涂布于NA平板[12]。油菜內生菌分離：稱量1 g的油菜根組織，表面消毒后，充分研磨，梯度稀釋，取適量的10?4，10?5，10?6稀釋液涂布于NA平板。將上述的NA平板置于28°C培養箱中，48 h后挑取顏色、光澤、邊緣光滑度和厚度不同的單菌落于新的NA平板上進行劃線培養，所得菌株斜面保存，備用。

1.3 西瓜枯萎病拮抗菌株的初篩

采用平板對峙法[13]，將病原菌（FON）菌餅接種至PDA平板中央，在平板兩側距平板中央各2.5 cm的地方平行劃線接種待測細菌，于28 ℃培養箱中培養。每個處理3次重復，4 d后測量各處理的抑菌帶大小。

1.4 西瓜枯萎病拮抗菌株的復篩

將初篩的菌株分別接種于NB中，于28°C、130 r/min的搖床上培養48 h。在PDA平板中央接種培養72 h的西瓜枯萎病菌菌餅（直徑6 mm），用無菌的打孔器在距離中央2 cm處三點對稱打孔，每孔中分別注入100μL待測菌株的菌液，以接種等體積的NB為對照，每個處理3次重復，平板置于28 ℃恒溫培養箱中培養，待對照平板中西瓜枯萎病菌菌絲即將長滿全皿時，測量各處理組的抑菌帶大小。

1.5 菌株YZU-S8抑菌譜的測定

參照Jeong等[14]并稍作改進，制備YZU?S8的無菌濾液，將無菌濾液混入冷卻至55 ℃左右的PDA中，使其終濃度分別為5%、10%和20%，倒成平板。以混入相同體積的NB為對照。在PDA平板中央接入待測病原菌菌餅，28 ℃倒置培養。每處理4次重復。待對照組菌絲幾乎長滿培養皿時，測量各組的菌落直徑，計算相對抑制率[15]。

1.6 YZU-S8對西瓜枯萎病的盆栽防效測定

挑取健康、飽滿的西瓜種子，進行常規的播種處理[16]。待西瓜幼苗長出第3片真葉后，將其移栽至塑料盆中[17]。實驗分為3個處理：（1）病原菌（FON）+提前3 d接種YZU?S8；（2）病原菌（FON）+同時接種YZU?S8；（3）病原菌（FON）+NB。

將FON接種到PDB中，28 ℃、130 r/min振蕩培養5 d，所得菌液用無菌紗布過濾后得到分生孢子懸浮液，將其混入無菌基質土中制成病土（105個孢子/克）。制備YZU?S8懸浮液（108cfu/mL），接種時對西瓜幼苗進行灌根，每株接種30 mL。以接種等體積的NB為對照，每個處理15株西瓜苗，3次重復。西瓜植株均放置于（25±2）℃溫室中培養，光照∶黑暗=12 h∶12 h。接種病原菌（FON）后21 d，參照王夏雯等[18]方法，調查西瓜植株的發病嚴重度和計算相應的病情指數、防效。

1.7 YZU-S8對西瓜植株的促生長測定

西瓜的種植、生防菌液的制備和接種同1.6。以接種等體積的NB為對照，每處理12株西瓜植株，3次重復。將西瓜植株放在（25±2）℃溫室中培養，光照∶黑暗=12 h∶12 h，30 d后測量并記錄西瓜植株的主蔓長、根長、鮮質量和葉綠體含量等指標。

1.8 YZU-S8的分子鑒定

使用OMEGA細菌基因組提取試劑盒提取YZU?S8的總DNA，采用16S rDNA基因通用引物（27F：5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′和1492R：5′?GGTTACCTTGTTACGACTT?3′）[19]進行PCR擴增。反應體系：PCR StarMix 20 μL、正引物1.0 μL、反引物1.0 μL、DNA 2.0 μL和ddH2O 16 μL；擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 °C變性40 s、58 °C退火40 s、72 °C延伸60 s，變性、退火和延伸循環30次后于72 ℃繼續延伸10 min。取少量PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產物送至擎科新業生物技術有限公司測序。所得序列在NCBI的GenBank中進行比對分析，利用MEGA7.0軟件構建系統發育進化樹。

1.9 數據分析

采用SPSS 17.0進行Duncan’s多重比較，檢驗組間差異顯著性，數據表示為平均數±標準差。

2 結果與分析

2.1 西瓜枯萎病拮抗菌株的分離和初篩

從油菜根及根際土樣品中共分離得到內生細菌和根際細菌127株，經平板對峙初篩出17株對西瓜枯萎病菌有拮抗作用的細菌，其中70%為根際細菌（表1）。

表1 西瓜枯萎病拮抗細菌的分離和初篩Tab.1 Isolation and screening of biocontrol bacteria against watermelon Fusarium wilt

2.2 西瓜枯萎病拮抗菌株的復篩

拮抗菌株的復篩結果表明，抑菌帶寬超過5 mm的菌株共有7株，其中內生細菌YZU?S8對西瓜枯萎病菌的抑制活性最強，形成的抑菌帶寬達10 mm以上（表2），作為后續研究的菌株。

表2 西瓜枯萎病生防細菌的復篩Tab.2 Secondary screening of biocontrol bacteria against watermelon Fusarium wilt

2.3 菌株YZU-S8的抑菌譜測定

抑菌譜測定結果表明，YZU?S8的無菌濾液在不同濃度下對9種供試的病原菌均有抑制作用（表3），濃度為20%時其抑制率為40.35%～98.95%，其中對白芨白絹病菌的抑制率最高（98.95%）。

表3 菌株YZU-S8的抑菌譜測定Tab.3 Antifungal spectrum of YZU-S8

2.4 YZU-S8對西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽防效結果表明，只接種西瓜枯萎病菌的植株病情指數為81.33，而提前3 d和同時接種YZU?S8菌株的植株病情指數分別為21.33和40.00，相對防效分別為73.8%和50.8%（表4）。

表4 菌株YZU-S8對西瓜枯萎病的盆栽防效Tab.4 Control effect of YZU-S8 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment

2.5 YZU-S8對西瓜植株的促生作用

促生試驗結果表明，接種生防菌YZU?S8后30 d，西瓜植株長勢與對照相比存在顯著差異，其主蔓長和根長的增加量分別為8.01 cm和8.34 cm，地上鮮質量增加了6.88 g（表5）。

表5 YZU-S8對西瓜植株的促生作用Tab.5 Effect of YZU-S8 on the growth of watermelon plants

2.6 YZU-S8的分子鑒定

YZU?S8菌株的16S rDNA序列長度為1 381 bp，BLAST結果表明其與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）S1?5?7的16S rDNA序列具有100%的相似度。系統發育進化樹顯示菌株YZU?S8與貝萊斯芽孢桿菌在同一分支上（圖1），初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖1 基于YZU?S8的16S rDNA序列及其相似序列構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA of YZU?S8 and its homologous sequences

3 討論與結論

植物根際細菌和內生細菌通常在植物的生長發育和對病害的防御過程中起著重要的作用，在長期的進化中與植物之間建立了友好的共生關系，是植物病害生防菌劑的重要來源，具有巨大的開發價值[20?21]。國內外已經有許多關于植物根際細菌和內生細菌防治植物病害的報道[22?24]。為了拓寬西瓜枯萎病生防菌株的來源，獲得更高效的拮抗菌，本研究從油菜根和根際分離篩選出一株對西瓜枯萎病菌具有顯著抑制活性的內生菌株YZU?S8，經鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。YZU?S8的無菌濾液對病原真菌表現出了廣譜的抑制作用，表明其可產生具有抑菌效果的活性代謝產物。然而，該菌株能合成的抑菌物質的成分尚不明確，需要進一步研究。

防病和促生是生防菌株應用于生產實踐所必備的兩大功能，也是篩選拮抗菌株的主要指標[25]。趙佳等[26]篩選得到的解淀粉芽孢桿菌Lh?1對西瓜枯萎病的盆栽防效為78.5%，且對西瓜植株具有顯著的促生作用。在本研究中，菌株YZU?S8在盆栽實驗中對西瓜枯萎病也表現出了良好的防效，且該菌株對西瓜植株具有顯著的促生作用，使其蔓長、根長和鮮質量有了明顯的增加，這有助于增強西瓜的抗病能力，進而降低西瓜枯萎病的發病率。因此，菌株YZU?S8在防治西瓜枯萎病方面具有良好的開發潛力。

生防菌的田間防效易受土壤條件、作物生長狀況及根際生態系統等多種因素的影響，導致防效不穩定，嚴重阻礙了生防芽孢桿菌的推廣應用[27]。此外，生防芽孢桿菌與病原微生物的競爭作用是其防治植物病害的重要作用機制之一[28]。因此，需要進一步研究菌株YZU?S8對西瓜枯萎病的田間防效和在西瓜植株上的定殖能力，為其研發應用提供更多的實踐基礎。