蔬菜根結線蟲生防放線菌LY4的篩選及其鑒定

張 琦，申 帥，胡先奇*

（1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南昆明 650201；2.云南農業大學植物保護學院，云南昆明 650201）

【研究意義】植物根結線蟲是世界范圍內主要的農業害蟲，主要寄生于植物的根部組織，據統計，全球每年因植物根結線蟲造成的直接經濟損失就高達1 570億美元[1]，世界農業平均減產24.5%[2]。植物根結線蟲不僅能通過分泌物感染寄主，而且還能為其他病原微生物的感染打開通道，引起繼發病害。化學防治一直作為根結線蟲防治的主要手段，但其帶來的對環境的嚴重破壞，其殘留物對人畜的毒害等副作用也日益凸顯。而抗病品種的應用目前并不廣泛；作物輪作的方法對發展中國家和人口眾多的國家來講，糧食需求量巨大，務農者經濟收入降低等因素并未廣泛應用[3]。所以近年來，生物防治手段因低毒、高效、人畜無害、環境友好的優點，其探索日益發展迅速?！厩叭搜芯窟M展】微生物是植物根結線蟲生物防治劑豐富的天然來源，放線菌在防治植物寄生線蟲中起重要作用，Rashad等[4]從20份土壤樣品中分離出了29株具有殺線活性的鏈霉菌。陳井升等[5]從大豆根際土壤中分離出了具有殺線活性的鏈霉菌S.par?vusH?2。Kaur等[6]報道了一種來自氫鏈霉菌菌株DH16的新型抗真菌化合物，該菌株發酵液上清液具有較強的殺線蟲活性。金娜等[7]發現紅灰鏈霉菌HDZ?9?47在田間施用時可有效地防治南方根結線蟲病。Manish等[8]報道了具有殺線蟲活性鏈霉菌菌株M7。Ruanpanun等[9]報道了鏈霉菌屬CMU?M021產生兩種抗真菌化合物，其中化合物Fervenuline對二齡幼蟲具有較高的致死率。胡夢君[10]報道了放線菌菌株1331發酵液可有效地抑殺南方根結線蟲，并在溫室盆栽試驗中取得了較好的防治效果。焉小寧等[11]分離得到對南方根結線蟲具有較高生物活性的玫瑰暗黃鏈霉菌。周銀麗等[12]報道了淡紫灰鏈霉菌MZ11不但對石榴枯萎病菌具有較好的室內拮抗作用，其50%濃度的發酵液對南方根結線蟲卵孵化也具有較好的抑制效果。

【本研究切入點】到目前為止，已經陸續發現很多對根結線蟲具有較好抑制活性的放線菌，但是大部分生防菌的研究仍停滯在實驗室研究階段，只有為數不多的生物防治劑被商業化并在該領域大規模應用[13]。生物防治劑能否成功應用的關鍵制約因素是它們在各種環境條件下的作用性能能否保持穩定[14]。【擬解決的關鍵問題】本試驗以云南農業大學農場、昆明撈魚河濕地公園以及云南省陸良縣土樣中分離出的101株放線菌為篩選對象，通過其發酵液上清液及土壤穩定性試驗篩選用于防治南方根結線蟲病的生防菌，以期為南方根結線蟲病的防治拓寬新的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 采自云南農業大學農場、昆明撈魚河濕地公園、云南省陸良縣土壤樣本。選取每塊田地的四角位置和中間位置為采集點。采集時，在植株周圍選3處不同位置用鐵鏟挖至10～15 cm處，每個位置取100 g左右的土壤去除肉眼可見較大明顯的石塊或者腐質，然后裝至無菌自封袋中，混合均勻，帶回實驗室后去雜和過篩處理[12]。

1.1.2 培養基 放線菌分離培養基：放線菌的分離采用高氏合成1號瓊脂培養基。放線菌發酵培養基：高氏合成1號液體培養基。

1.1.3 供試線蟲 南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）：來自云南農業大學線蟲實驗室。

1.1.4 供試植株和藥劑 空心菜：云南農業大學線蟲實驗室保存。1%阿維菌素顆粒：山東省綠士農藥有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌的分離和純化 放線菌的分離采用稀釋涂布平板法[15]。放線菌的純化：在培養的第7天挑取單菌落至高氏1號固體培養基上劃線純化，將純化后的培養基置于28 ℃培養箱中培養7 d后，挑取單菌落，再度在高氏1號固體培養基上劃線純化。然后挑取純化好的單菌落接種于高氏合成1號固體培養基上，28 ℃下培養并編號。

分離、純化共獲得放線菌101株。分別來自云南農業大學試驗田編號為YN1～YN30，昆明撈魚河濕地公園編號為LY1～LY47，云南省陸良縣編號為LP1～LP22、JG1～JG4、GT6。

1.2.2 二齡幼蟲蟲懸液的制備 將收集挑取的卵塊放在消毒過的中性濾紙上，置于消毒過的網篩上，再將網篩放置在盛有無菌水的培養皿中，使水剛好浸濕濾紙，然后一起放到28 ℃培養箱中孵化，每12 h收集一次線蟲于敞口的燒杯中（燒杯中淺水即可）。放于4 ℃冰箱保存備用（切勿水干）。

1.2.3 根結線蟲生防菌的初步篩選 （1）放線菌發酵液的制備：因所要發酵的菌種較多所以選用50 mL的離心管作為發酵容器，每管裝30 mL經滅菌過的高氏合成1號液體培養基[16]。然后用接種針挑取純化后的菌絲于液體培養基中，180 r/min，28 ℃條件下振蕩培養96 h。（2）發酵液對二齡幼蟲的影響：將發酵液在8 000 r/min離心5 min，取上清液3 mL到直徑6 cm的小培養皿中。再將無菌水沖洗過的線蟲加入培養皿中，定容線蟲濃度為30條/mL（每皿100條左右），以無菌水作為對照組，3次重復。放入28 ℃恒溫箱中24 h之后鏡檢各處理線蟲的死亡率并計算校正死亡率。僵直不動，用牙簽或挑針戳動仍然僵直無活性的判為死亡。計算線蟲死亡率和校正死亡率公式為[17]：

1.2.4 根結線蟲生防菌的進一步篩選 經初篩后，選取具有高效殺線活性的放線菌發酵液進行進一步復篩，按1.2.3步驟發酵液離心后，取上清液稀釋1.25倍、2倍和5倍，分別測試對二齡幼蟲的擊倒率，以清水為對照組，3次重復，24，48，72 h后鏡檢記錄。

1.2.5 土壤穩定性試驗 取顆粒飽滿的空心菜種子，先用2%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min。然后，用無菌水多次沖洗干凈，再放置清水中浸泡過夜，第二天將種子放在濕潤的中性濾紙上，置于培養皿中，28 ℃恒溫箱黑暗培養催芽。

邊長7 cm、高度8 cm的小盆中分別裝入滅菌土，滅菌土比例按m（紅土）∶m（腐殖土）=3∶1配置。將發芽的種子移栽自盆中，每盆一株，溫室培養10 d后，每盆用30 mL的發酵液原液灌根，灌根后，即接入線蟲，每株400頭左右。以1%阿維菌素為標準對照組，清水為空白對照組。1%阿維菌素對照組采用顆粒劑與滅菌土混勻回填的方式施藥[10]，施藥劑量約為500 mg/kg。每組5次重復，30 d后隨機處理3個重復，觀察統計根結數量，統計根結百分比率，分析病害級別，計算病情指數和防治效果。

根結百分比率（%）：根系中的根結占整個根系的比例（目測，估計）。

根結線蟲分級標準參照Hartman[18]的方法。0級：根系完整，無根結；1級：僅有少量根結，根結百分比率小于1/4；3級：根結百分比率為1/4～1/3；5級：根結形成中等數量，根結百分比率為1/3～1/2；7級；根結數量較多，根結百分比率大于1/2；9級：根部長滿根結。

1.2.6 生防菌LY4的鑒定 培養特征：將放線菌菌株LY4分別接種到高氏合成1號瓊脂培養基、無機鹽淀粉培養基、甘油?天門冬酰胺培養基、酵母膏?麥芽糖瓊脂培養基、酪氨酸瓊脂培養基、PDA培養基、葡萄糖硝酸鹽培養基、察氏培養基上，28 ℃培養7～15 d。借鑒參考文獻[19?20]的方法，觀察菌株氣絲、基內菌絲在各種培養基上的形態特征、顏色，有無可溶性色素及生長等情況。

生理生化鑒定借鑒參考文獻[20]的方法。（1）明膠液化。將菌種穿刺接種到明膠液化培養基，28 ℃培養7～15 d觀察其液化情況。觀察前先將菌種管放置4 ℃冰箱中冷藏20～30 min。若明膠仍是固體，則不液化；若有液體，則明膠液化。（2）酪氨酸水解。將菌種接種到酪氨酸瓊脂培養基上，28 ℃培養7～15 d，觀察是否有黑色素產生。若有黑色素產生，說明菌株具有酪氨酸酶。（3）硫化氫生成。將菌種穿刺接種到硫酸亞鐵瓊脂培養基上，28 ℃培養7～15 d觀察是否有黑褐色色素產生。若有，則有H2S產生，H2S與檸檬酸鐵生成黑色硫化鐵。（4）纖維素上生長。將菌種接種到纖維素剛果紅培養基上，28 ℃下培養7 d，觀察菌株生長情況。若菌株正常生長則能利用纖維素，若無法生長，則不能利用纖維素。（5）碳源利用。不同放線菌利用不同碳源的能力差異很大。將菌株接種到不同碳源的培養基上觀察其生長狀況。若菌落生長表明可利用該碳源，反之則不能利用該碳源。

1.2.7 菌株LY4的分子鑒定 DNA的提取，借鑒飽和酚法[21]。16S rDNA的PCR的擴增：采用細菌通用引物27F和1492R進行PCR擴增。

PCR反應體系：2×PowerTaqPCR MasterMIX 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 8.5μL，總體積25μL。

測序及分析：將呈陽性的菌液送至生工生物工程股份有限公司進行測序，所得序列用BLAST在Gen-Bank中進行同源性對比，再用MEGA6.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 根結線蟲生防菌的初步篩選

從云南農業大學農場、昆明撈魚河濕地公園采集和云南省陸良縣采集的土壤樣本中，分離到101株菌落特征各不相同的放線菌，通過發酵液原液上清液的初步篩選獲得3株防效高于90%的放線菌菌株LY4、LY8和GT6。

2.2 根結線蟲生防菌的進一步篩選

24，48，72 h后，3株放線菌的發酵上清液在3種不同濃度的稀釋倍數下對南方根結線蟲都有抑殺作用。3株放線菌發酵上清液在1.25倍稀釋倍數下，處理南方根結線蟲48 h后的的校正死亡率都能達到100%；在5倍的稀釋條件下，處理南方根結線蟲72 h后的校正死亡率都能達到70%以上，其中菌株GT6效果最好，達92.60%，與菌株LY4、LY8差異顯著（表1）。

30 d后各植株的防治效果如表2，可以看出，防效最好的是LY4，而在離體生測試驗中效果最好的GT6在盆栽試驗中防治效果反而并不突出。

2.3 生防菌LY4的鑒定

2.3.1 形態和培養特征 在高氏合成1號瓊脂培養基上氣生菌絲為白色、較薄，菌落表面干燥、絨狀，凸起?；z粉紅色略顯淡紫色，有紫色可溶性色素。孢子絲直，孢子橢圓形，表面光滑（圖1）。放線菌LY4在各種鑒定培養基上的培養特征（表3）。

2.3.2 生理生化特征 放線菌菌株LY4能利用蔗糖、D?棉子糖、D?半乳糖、肌醇、D?甘露糖，不能利用D?木糖、D?果糖、L?鼠李糖、D?阿拉伯糖。明膠液化，不產類黑色素和H2S，不能利用纖維素（表4）。

2.3.3 16S rDNA序列測定及系統發育樹分析 用提取的DNA為模板，細菌通用引物27F、1492R為引物進行PCR擴增，放線菌LY4的16S rDNA擴增產物大小1 500 bp左右（圖2）。

表1 3株放線菌的發酵上清液在3種不同濃度的稀釋倍數下對南方根結線蟲抑殺作用Tab.1 Antifungal effect of fermentation supernatants of three actinomycetes on southern root-knot nematodes at three different concentrations

表2 土壤穩定試驗（30 d）Tab.2 Soil stability test

圖1 菌株LY4的顯微照片（400×）Fig.1 The microscopy morphology of the strain LY4（400×）

表3 放線菌LY4在各種鑒定培養基上的培養特征Tab.3 Culture characteristics of actinomycetes strains LY4 in different media

表4 菌株LY4的生理生化特征Tab.4 Physiological and biochemical characteristics of strain LY4

PCR產物的回收與純化及分子克隆測序獲得的菌株LY4的16S rDNA序列1 469 bp，與GenBank中相關序列進行Blast相似性對比，放線菌菌株LY4與淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）的16S rDNA序列同源性為99.05%，建立系統發育樹（圖3）與淡紫灰鏈霉菌（D85114.1）處于同一分支。結合形態特征、生理生化特征以及系統發育樹的分析，初步將放線菌菌株LY4鑒定為淡紫灰鏈霉菌。

3 結論與討論

本研究以土壤中分離、篩選出的101株放線菌菌株為對象，經初步篩選得到3株對南方根結線蟲致死率高于90%的放線菌菌株：LY4、LY8和GT6。LY4、LY8和GT6發酵液原液稀釋2倍和5倍的條件下處理南方根結線蟲二齡幼蟲72 h的校正死亡率分別為99.64%、98.67%、100.00%和78.85%、73.16%、92.60%，在土壤穩定性試驗中，3組防效差異顯著，LY4相較于LY8組和GT6組，防效最好，防效為71.10%。結合菌株LY4在鑒定培養基上的形態特征和培養特征、生理生化鑒定和16S rDNA的多項指標分析，初步將放線菌菌株LY4鑒定為淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）。

目前，關于放線菌對根結線蟲致死效果和對卵孵化的抑制效果已有很多報到，大部分都集中在鏈霉菌屬，例如：密旋鏈霉菌（S.pactum）和婁徹氏鏈霉菌（S.rochei）、針孢鏈霉菌（S.aculeolatus）、淡紫灰鏈霉菌MZ11、灰肉紅鏈霉菌HA0701、紅灰鏈霉菌HDZ?9?47等[19,22?23]。已經用于商業化的阿維菌素、尼克霉素等也是由鏈霉菌產生。本試驗篩選出的放線菌發酵液原液對南方根結線蟲二齡幼蟲具有較高的致死率，其原因可能有兩個方面：（1）次級代謝產物中具有殺線活性的物質使線蟲受到毒害。（2）菌體或孢子本身對線蟲具有寄生作用進而殺死線蟲。目前，除蟲鏈霉菌代謝產物中的大環內酯化合物已進行商業化開發，本試驗中放線菌發酵液次級代謝產物的活性物質及對線蟲的作用機制還需進一步探究。

圖2 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The 16S rDNA electrophoretogram of the LY4

圖3 以16S rDNA為基礎構建的LY4菌株系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LY4 based on 16S rDNA sequence

在土壤穩定性試驗中，菌株LY4的防效為71.10%，其效果好于玫瑰暗黃鏈霉菌的52.80%，推測可能是與灌根施加的發酵液原液的量有關。在離體生測試驗中效果最好的是菌株GT6，但在土壤穩定性試驗中表現卻并不突出，所以在實驗室內有良好抑制效果的菌株未必在土壤復雜的微生物環境中依然良好，而在實驗室內抑制效果一般的菌株也可能在土壤復雜的微生物環境中表現良好。本試驗所篩選出的放線菌菌株LY4雖然在體外生測試驗和溫室小盆栽試驗中對根結線蟲具有一定的防治作用，但在大田試驗中是否有比較好的效果，還需進一步深入探究。