DNA甲基化修飾在甲狀腺癌中的研究進展

林松榮，張 磊，羅金現，秦克旺

(1.南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510317；2.廣東省第二人民醫院，廣東 廣州 510317)

甲狀腺癌是世界范圍內最常見的內分泌系統惡性腫瘤，盡管相對少見，但是一些流行病學研究[1]表明，其發病率在過去幾十年中仍逐漸增加，其原因可能與頸部超聲等成像技術的改進和廣泛應用有關。目前發現DNA甲基化是調節甲狀腺癌進展的重要因素。DNA甲基轉移酶(DNMT)催化的DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一，在控制基因表達和維持基因組結構上扮演著關鍵角色。異常DNA甲基化通常發生在轉錄因子的啟動子區域，主要通過高甲基化或低甲基化導致腫瘤的發生。DNA高甲基化表示甲基化的獲得，常常發生在抑癌基因上，導致其轉錄的抑制和表達的下降；而DNA低甲基化則表示甲基化的缺乏，可激活原癌基因并影響染色體的穩定性。DNA甲基化是人類腫瘤早期分子變化的表征和反映，這預示著對其的開發研究有望提供一種早期識別和預防腫瘤的新方法。

1 甲狀腺癌中抑癌基因甲基化

與其他腫瘤一樣，異常甲基化導致腫瘤抑制基因的不適當沉默，在甲狀腺癌中廣泛存在。這些抑癌基因包括ARAS相關區域家族基因1A(RASSF1A)、第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)、組織金屬蛋白酶抑制劑3(TIMP3)、死亡相關蛋白激酶(DAPK)、維甲酸受體β2(RARβ2)、上皮鈣黏附素(ECAD)、MutL同源基因1(MLH1)、p16及共濟失調-毛細血管擴張突變基因(ATM)等。通常這些基因具有良好的抑癌作用，但是異常高甲基化使得上述基因的表達降低，繼而促進了甲狀腺癌的發生與發展。

1.1 RASSF1A RASSF1A是最常被描述的抑癌基因之一，在許多腫瘤中可以觀察到它的失活。RASSF1A影響多種細胞過程，包括參與基因組穩定性維護、微管動力學、細胞周期調控、細胞凋亡和細胞運動等，啟動子高甲基化使得上述功能丟失，從而促進腫瘤的發生。Brown等[2]的研究顯示，在甲狀腺濾泡性增生(FTH)中，RASSF1A啟動子高甲基化及其導致的基因表達沉默經常發生，推測RASSF1A可能在甲狀腺腫瘤形成的早期發生甲基化，并有助于FTH向甲狀腺腺瘤(FA)和甲狀腺癌演變。Kunstman等[3]報道，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中RASSF1A平均高甲基化水平是正常甲狀腺組織的4.2倍，且RASSF1A甲基化與PTC的多灶性明顯相關，但與囊外侵襲呈負相關。Stephen等[4]研究發現，Classic型FTC和Hurthle型FTC間RASSF1A甲基化程度差異明顯，Classic型FTC的RASSF1A甲基化水平較高，提示RASSF1A甲基化程度可作為區分這兩種FTC亞型的分子標記。

1.2 PTEN PTEN的表達產物被認為是一種脂質和蛋白質雙重磷酸酶，后者通過脂質磷酸酶活性負向調控PI3K/AKT信號通路而發揮抑癌作用。在甲狀腺癌中，PTEN受抑制的頻率高于突變或缺失的頻率，很可能是基因啟動子區的高甲基化引起其表達抑制[5]。Hou等[6]研究了良性甲狀腺腺瘤、FTC和甲狀腺未分化癌(ATC)中PI3K/AKT通路基因改變與PTEN甲基化的關系，發現PTEN甲基化程度隨著腫瘤惡性程度的升高而增加，同時PTEN異常甲基化增強了PI3K/AKT通路的信號傳遞，后兩者的相互作用可能促進了甲狀腺腫瘤的發展。Alvarez-Nunez等[5]研究顯示，FA和FTC中PTEN甲基化發生率分別為83%和85%，PTEN高甲基化可能在甲狀腺腫瘤(尤其是濾泡性腫瘤)的發生中起作用。

1.3 TIMP3 TIMP3是基質金屬蛋白酶(MMPs)的內源性抑制劑，與MMPs結合能有效抑制后者活性，通過誘導細胞凋亡、抑制腫瘤增殖、抑制血管生成和轉移而發揮抑癌作用。TIMP3啟動子是一個經常被靶向的甲基化位點，其高甲基化所致表達沉默在多種腫瘤中具有致癌性[7]。Hu等[8]研究顯示，PTC中TIMP3甲基化與腫瘤的腺外侵犯、淋巴結轉移和多灶性密切相關。

1.4 DAPK DAPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過調節不同的信號事件發揮作用，包括細胞凋亡、自噬和膜起泡，促進細胞凋亡為其基本功能。DAPK在包括甲狀腺癌的多種癌癥中處于失活狀態，很大程度上歸因于基因啟動子區的高甲基化。在Hu等[8]的研究中，PTC中DAPK啟動子甲基化率為34%(78/231)，且DAPK甲基化與腫瘤的多灶性和大小有關。

1.5 RARβ2維甲酸受體(RARs)是類固醇激素受體超家族成員，通過與維甲酸類物質相互作用而發揮調節細胞生成、分化、凋亡以及抑制多種組織癌變的作用。目前大多數研究聚集在RARβ2。RARβ2在多種腫瘤的發生發展過程中表達減少，部分研究認為是由于其基因啟動子區CpG島甲基化導致表觀遺傳沉默。黃鈾新等[9]對循環腫瘤DNA的研究表明，RARβ2甲基化率在甲狀腺癌組中明顯高于甲狀腺良性結節組，且與甲狀腺癌臨床分期相關，同時研究結果提示RARβ2異常甲基化與甲狀腺癌的發生、發展有關。Kiseljak-Vassiliades等[10]研究證實，在PTC中TIMP3、SLC5A8及DAPK甲基化與吸煙僅有關聯趨勢，而RARβ2甲基化與吸煙有統計學相關，但是對于后兩者的相互作用如何促進PTC發生仍有待研究。

1.6 ECAD ECAD是經典的腫瘤抑制因子，其編碼產物是一種黏附蛋白，在維持細胞黏附和上皮細胞表型方面發揮重要作用。ECAD表達丟失主要發生在表觀遺傳學水平，并且與腫瘤的進展和轉移有關[11]。Jensen等[12]報道，PTC中ECAD甲基化率為39.3%(26/66)，并與甲狀腺外侵襲和轉移有關，同時該研究提示表觀遺傳機制和腫瘤壞死因子(TNF)誘導的信號通路各自獨立地調控ECAD的表達和定位，這些機制既促進了甲狀腺癌細胞的侵襲性，也可能在原發腫瘤中誘導上皮向間質轉化以及淋巴結轉移瘤中促使間質向上皮轉化方面發揮重要作用。

1.7 MLH1 MLH1是錯配修復基因之一，其編碼的蛋白質產物是DNA錯配修復通路的組成部分，可在復制過程中有效地替換錯配堿基，防止DNA損傷的累積。MLH1甲基化常常先于胃癌、肺癌和乳腺癌等的惡性增殖出現，因此其甲基化檢測可用于腫瘤發生的預測[13]。陸曉筱等[14]研究發現，MLH1基因啟動子甲基化與PTC的大小、多灶性、腺外侵犯、T分期和頸部淋巴結轉移緊密相關，該基因的甲基化檢測有望成為PTC早期篩查和手術評估的指標。Santos等[15]研究指出，在PTC、FTC和良性甲狀腺病變中，MLH1甲基化率分別為44%、33%和64%，并且MLH1表達降低與BRAF V600E突變、RET/PTC重排和轉換(IDH1和NRAS)有關。

1.8 p16 P16基因又稱多腫瘤抑制基因(MTS1)，其編碼產物是一種細胞周期的負調節因子，通過與CDK4或CDK6結合，抑制CDK4或CDK6與細胞周期蛋白D之間復合物的形成，阻斷Rb蛋白磷酸化，誘導細胞G1期阻滯，進而調控細胞周期。p16在PTC中表達失調很少通過突變引起，已有的研究表明CpG島甲基化是p16失活的重要因素。Wang等[16]研究顯示，p16在PTC中的甲基化率為27%(20/74)，并與腫瘤TNM分期、高AMES(年齡、遠處轉移、腺外浸潤、大小)及轉移呈正相關，認為p16甲基化與PTC生物學轉移特性和組織學特征相關。戴亞麗等[17]研究指出，PTC中p16的甲基化率為54%(27/50)，且該基因甲基化與PTC的發生和發展有關。

1.9 ATM ATM在維持基因組穩定性和提高細胞生存率方面具有重要作用，其編碼的蛋白質能夠激活不同的效應底物，參與細胞周期調控、DNA雙鏈修復以及細胞凋亡等過程。Brait等[18]研究顯示，ATM在正常甲狀腺組織、良性甲狀腺腺瘤和甲狀腺癌中的甲基化頻率分別為80%、53%和71%。

2 甲狀腺癌中原癌基因與甲基化

2.1 BRAF與DNA甲基化 BRAF突變是PTC中最常見的遺傳事件，其參與甲狀腺癌發生的主要信號途徑是RAS/BRAF/MEK/ERK通路。BRAF突變通常導致PTC具有侵襲性的臨床病理特征和更差的預后。目前的一些研究認為甲狀腺癌中BRAF突變與腫瘤抑制基因甲基化關系密切。Hu等[8]研究了PTC中抑癌基因甲基化與腫瘤臨床病理特征及BRAF突變的關系，結果顯示TIMP3、SLC5A8、RARβ2及DAPK的甲基化與PTC的一些侵襲性特征和BRAF突變有關，并推測上述抑癌基因的甲基化可能是BRAF突變促進PTC發生及侵襲性形成的重要環節。Botezatu等[19]研究發現，在BRAF突變陽性的甲狀腺癌樣本中抑癌基因TIMP3、RARB、MGMT及NEUROG1的甲基化值較高，表明BRAF突變與這些基因甲基化顯著相關。

另外有研究分析了BRAF突變和甲狀腺癌DNA整體低甲基化的關系(Alu重復序列整體低甲基化作為DNA整體低甲基化的替代標記)，發現在遠處轉移的分化型甲狀腺癌(DTC)中，伴有BRAF突變的腫瘤Alu低甲基化增加，表明BRAF突變與DNA整體低甲基化相關，同時BRAF突變與遠處轉移性DTC相關，但與低風險DTC無關[20]。

2.2 其他原癌基因與DNA甲基化 腫瘤中原癌基因的甲基化形式通常為低甲基化，這在包括甲狀腺癌的大多數腫瘤中已有報道。Rodríguez等[21]利用DNA甲基化陣列對甲狀腺癌異常DNA甲基化的整體模式進行確定時，在非分化型甲狀腺癌中發現四個潛在的原癌基因(INSL4、DPPA2、TCL1B和NOTCH4)經常受到低甲基化的調節。

3 甲狀腺癌中甲狀腺特異性基因甲基化

甲狀腺特異性基因主要包括促甲狀腺激素受體(TSHR)、鈉-碘轉運體(NIS)、甲狀腺球蛋白(TG)和甲狀腺過氧化物酶(TPO)基因，這些基因在甲狀腺濾泡上皮細胞中特異表達，在吸收、濃縮和利用碘方面起重要作用。甲狀腺特異性基因在甲狀腺癌中的表達經常降低，雖然這些基因沉默的具體機制還不清楚，但是異常的DNA甲基化被認為是一個關鍵原因。Khan等[22]研究發現，甲狀腺癌患者中TSHR基因甲基化率為25%(15/60)，其中伴有BRAF V600E突變的患者中TSHR甲基化率為73.3%(11/15)，說明BRAF V600E突變與TSHR甲基化有明顯相關性，同時研究認為針對BRAF/MEK/MAP激酶途徑為靶點的治療可能是恢復甲狀腺特異性基因表達的有效方法。Galrao等[23]在研究中發現了一種新的遠端增強子，即NIS遠端增強子，可通過DNA高甲基化使得甲狀腺腫瘤中DNA表達降低，這可能是腫瘤發生的早期事件。TSHR及NIS的表達在甲狀腺癌中經常丟失，引起碘吸收降低，最終導致甲狀腺癌放射性碘治療的失敗。

4 DNA甲基化與甲狀腺癌診治

4.1 甲狀腺癌診斷 隨著對DNA甲基化認識的不斷深入，利用DNA甲基化作為甲狀腺癌早期診斷標志物的想法已不新鮮。通過檢測這些DNA甲基化標記物，人們的目標是早期診斷甲狀腺癌，并從分子水平上區分甲狀腺癌亞型和甲狀腺良性結節，減少甲狀腺癌的過度診斷和手術。一項薈萃分析[24]顯示，RASSF1A啟動子甲基化與甲狀腺癌的易感性和無病生存率密切相關，對RASSF1A甲基化水平的檢測可用于甲狀腺癌的臨床診斷。Stephen等[25]應用甲基化定量PCR(QMSP)技術對甲狀腺病變石蠟包埋組織(FFPE)中21個候選基因的啟動子甲基化狀態進行單獨和組合分析，結果表明RASSF1A+TPO結合TPO+UCHL1的甲基化聯合檢測有助于鑒別FTC，RASSF1A+TPO甲基化組合有助于鑒別FA，TSHR甲基化檢測可用于鑒別PTC。雖然單個基因甲基化檢測的研究經常報道，但有些研究認為多個基因甲基化的聯合檢測更有利于提高標志物的靈敏度及特異度，增加甲狀腺癌的診斷價值。

4.2 甲狀腺癌治療 鑒于甲狀腺癌中相關基因高甲基化導致基因表達下調，使用改善這一變化的藥物誘導沉默的基因重新表達是當前的一個研究方向。DNA甲基轉移酶抑制劑是最早被認可的表觀遺傳藥物之一，在某些甲狀腺癌的治療試驗已經得到了報道。研究[26]發現，在PTC細胞中DNMT3A基因存在甲基化，通過去甲基化劑地西他濱處理后DNMT3A基因的表達得到了恢復。Vitale等[27]將地西他濱與依維莫司同時用于治療甲狀腺髓樣癌(MTC)細胞時，發現聯合用藥明顯提高了誘導細胞凋亡的能力，這為MTC和其他神經內分泌腫瘤的治療開辟了一個新的方案。一項Ⅱ期科學試驗研究了地西他濱能否恢復轉移性DTC對131I的攝取，結果顯示在使用地西他濱后，患者體內轉移性DTC病灶的131I攝取恢復，但該試驗同時存在的副作用不容忽視。已有的實驗證據顯示，去甲基化藥物在腫瘤細胞系中的應用獲得了有希望的結果，但是它們在臨床試驗中單獨應用時則沒有成功的案例，盡管如此，一些證據認為它們與其他藥物的聯合使用可能是一種潛在有用的治療方法[28]。

5 結 語

表觀遺傳修飾，特別是DNA甲基化，在腫瘤發病機制中的作用已經逐漸清晰。許多研究闡明了DNA甲基化作為新的分子標記物在臨床應用方面的潛力，DNA甲基化標記穩定，易在組織或體液中檢測，對甲狀腺癌的早期診斷、預后和治療效果的預測具有重大價值。在治療方面，根據DNA甲基化所開發的藥物尚未能證明在甲狀腺癌治療中的有效性。由于DNA甲基化在甲狀腺癌基礎科學研究上還有許多不足，因此將其轉化到臨床應用中仍有許多工作要做。