Nrf2為靶點治療支氣管肺發(fā)育不良的研究進展

張晗碩，梅 花，張亞昱

0 引言

支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早產(chǎn)兒呼吸系統(tǒng)的一種常見病，被認為是繼發(fā)性的高氧和炎癥造成的氧化損傷，從而導(dǎo)致肺泡形成障礙和慢性肺功能障礙，其危險因素可分為個體因素、醫(yī)源性因素和外部因素[1-2]。隨著極低出生體重兒和超低出生體重兒存活率的不斷增加,BPD已經(jīng)成為早產(chǎn)兒呼吸系統(tǒng)最重要的合并癥，嚴重者可并發(fā)肺動脈高壓，影響遠期呼吸功能、神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后[3]。

Northway等[4]在1967年首次將BPD定義為因機械通氣而導(dǎo)致的有呼吸窘迫綜合征的早產(chǎn)兒產(chǎn)生的肺病。美國國立兒童健康與人類發(fā)育研究所于2001年發(fā)表了BPD的診斷和分度標(biāo)準(zhǔn)，后于2018年修定了更為細化的BPD定義及分度標(biāo)準(zhǔn)。中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會新生兒學(xué)組聯(lián)合中華兒科雜志編輯委員會于2020年發(fā)表了更符合我國國情的BPD臨床管理專家共識[5]。雖然新生兒護理的發(fā)展提高了早產(chǎn)兒的存活率，但在降低BPD發(fā)生率方面取得的進展有限[6]。我國幾項多中心報道的BPD發(fā)生率差異較大[5]，其發(fā)生率居高不下的部分原因是可用于預(yù)防和治療BPD的選擇有限。所以,BPD仍是早產(chǎn)兒高發(fā)病率和高死亡率的主要原因，BPD的治療也仍然是一個重要的臨床問題。

1 Nrf2概述

核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2related factor 2,Nrf2)由605個氨基酸組成，分為7個功能域，分別稱為Neh1～Neh7：Neh1結(jié)構(gòu)域含有1個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(CNC-bZIP)，為DNA結(jié)合域；Neh2結(jié)構(gòu)域是1個N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，包含7個影響泛素結(jié)合的賴氨酸殘基和2個肽結(jié)合基序(ETGE和DLG)，ETGE和DLG基序與Keap1相互作用，它們通過促進Nrf2與不同蛋白質(zhì)的結(jié)合來調(diào)節(jié)Nrf2的穩(wěn)定性；Neh3結(jié)構(gòu)域為染色質(zhì)解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白6結(jié)合域；Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域；Neh6為β- 轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白(β-TrCP)結(jié)合域；Neh7結(jié)構(gòu)域為視黃酸Ⅹ受體α(RⅩRα)結(jié)合域[7-10]。

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)由624個氨基酸組成，分為5個結(jié)構(gòu)域，其中包含的Kelch重復(fù)序列被認為介導(dǎo)Keap 1與Nrf2和p62蛋白的結(jié)合[11-12]。平衡條件下，Keap1通過N-末端BTB結(jié)構(gòu)域進行同二聚化，并與Cull 3 E3連接酶結(jié)合，形成Keap 1-Cull3-RBX1(環(huán)盒蛋白-1) E3連接酶復(fù)合物，導(dǎo)致Nrf2泛素化和降解；在應(yīng)激條件下，Nrf2從Keap1-Cul3-RBX1復(fù)合物中釋放出來，轉(zhuǎn)移到細胞核中與小Maf蛋白(sMaf)異二聚體化，并與抗氧化反應(yīng)元件(AREs)結(jié)合，導(dǎo)致ARE驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄[13]。Nrf2/ARE通路在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[14]，該通路可調(diào)控谷胱甘肽和硫氧還蛋白抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵組分的表達，參與內(nèi)外源代謝產(chǎn)物的Ⅰ期、Ⅱ期解毒，調(diào)節(jié)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生和血紅素代謝，同時亦與許多腫瘤、炎性疾病、神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，已成為新型治療靶點[15-17]。

2 Nrf2為靶點治療BPD的依據(jù)-Nrf2對BPD的保護作用

由于人們經(jīng)常暴露在外部環(huán)境中，接觸各種污染物和其他氧化劑，所以Nrf2維持的氧化還原平衡對呼吸道相當(dāng)重要。目前研究顯示，Nrf2缺失會導(dǎo)致各種呼吸系統(tǒng)疾病的高度易感性和嚴重損傷，包括BPD、呼吸道感染、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、特發(fā)性肺纖維化和肺癌等，相反，Nrf2的激活對這些肺部疾病具有保護作用[15]。

Chu等[18]將早產(chǎn)大鼠暴露在高氧環(huán)境中，結(jié)果早產(chǎn)大鼠肺發(fā)育遲緩，其病理變化與BPD相似，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)大鼠高氧暴露后，Nrf2和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達明顯增加，具有保護作用。Zhang等[19]檢測了早產(chǎn)SD大鼠肺組織和高氧暴露的A549細胞中Nrf2和miR-125b的表達水平，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)大鼠肺組織中Nrf2和miRNA-125b在高氧暴露后明顯升高，具有保護作用。

Ma等[20]實驗發(fā)現(xiàn)，高氧組早產(chǎn)兒動物模型Nrf2和HO-1基因和蛋白的表達明顯高于對照組，并且發(fā)現(xiàn)BPD患兒的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性與對照組有顯著差異。Lin等[21]研究表明，Nrf2/HO-1軸可能在氣體遞質(zhì)對BPD的保護作用中起核心作用。McGrath-Morrow等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2能夠增加新生小鼠暴露于高氧的存活率，并且Nrf2可能有助于減輕高氧暴露引起的肺泡生長抑制。

以上研究驗證了Nrf2在BPD中的保護作用，提示Nrf2在BPD的防治方向上的巨大潛力。

3 以Nrf2為靶點治療BPD及其相關(guān)藥物的研究進展

Nrf2轉(zhuǎn)錄因子對細胞保護反應(yīng)至關(guān)重要，而Keap1作為一種Nrf2信號的內(nèi)源性抑制劑，會抑制這些保護反應(yīng)。暴露于高氧的Nrf2充足(野生型)新生小鼠出現(xiàn)肺泡發(fā)育不良，這一現(xiàn)象與人類BPD病相似，Nrf2缺乏使其惡化。Tamatam等[23]使用了帶有亞型Keap1 floxed等位基因(Keap1)且Nrf2水平增加的生后1d(PND1)幼鼠，以檢驗早產(chǎn)肺中Nrf2的組成水平不足以減輕高氧誘導(dǎo)的肺泡發(fā)育不良的假設(shè)，Keap1幼鼠不伴有肺泡生長抑制且抗氧化基因和谷胱甘肽表達水平增加，Keap1敲除導(dǎo)致出生后肺細胞增殖上調(diào)，但在高氧后有相反的作用。這項研究表明，通過靶向Keap1來增強內(nèi)源性Nrf2的激活，可能提供了一種防治BPD的生理學(xué)方法。

Zhao等[24]實驗發(fā)現(xiàn)，自噬激動劑雷帕霉素可以通過抑制p62磷酸化，促進Keap1降解，增加Nrf2核轉(zhuǎn)運，增加下游抗氧化酶表達，增強抗氧化能力，從而改善BPD大鼠肺泡結(jié)構(gòu)的簡化。這提示使用自噬激動劑來增強Nrf2-ARE通路活性并促進肺泡發(fā)育，可能是BPD抗氧化治療的新靶點[25]。

Cho等[26]利用新生Nrf2缺陷型[Nrf2(-/-)]和野生型[Nrf2(+/+)]小鼠，研究了Nrf2介導(dǎo)的分子事件在囊狀到肺泡型肺成熟過程中的作用，以及Nrf2在高氧性肺損傷發(fā)病機制中的作用。與Nrf2(+/+)新生兒相比，Nrf2(-/-)新生兒肺組織細胞周期、氧化還原平衡和脂質(zhì)/碳水化合物代謝基因的基礎(chǔ)表達降低，而淋巴細胞免疫基因高表達，在Nrf2(-/-)新生兒中，高氧誘導(dǎo)的表型，包括死亡率、囊泡期向肺泡期轉(zhuǎn)變的停止、肺水腫、伴隨DNA損傷和組織氧化的炎癥明顯比Nrf2(+/+)新生兒嚴重，新生兒期Nrf2缺乏加重了新生兒高氧所致的肺損傷和肺泡化的抑制。這提示了特異性Nrf2激活劑對包括BPD在內(nèi)的氧化應(yīng)激相關(guān)新生兒疾病有治療潛力。

Dunigan等[27]研究了硫氧還蛋白還原酶-1(TXNRD1)抑制劑誘導(dǎo)HO-1的機制，HO-1被認為是ARDS和BPD的潛在治療靶點。TXNRD1主要在氣道上皮細胞表達，可有效激活Nrf2反應(yīng)，減輕肺損傷，當(dāng)TXNRD1被抑制時，HO-1與Nrf2靶標(biāo)NADPH醌氧化還原酶-1(NQO1)不呈比例地增加，提示Nrf2是TXNRD1抑制劑增加肺上皮細胞HO-1的主要機制，可以成為BPD的治療靶點。

DL-3-正丁基苯酞(NBP)是由L-3-正丁基苯酞合成的外消旋體，Gong等[28]探討NBP對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ALI)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NBP可明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺濕干比升高、肺組織損傷、炎細胞浸潤、促炎細胞因子和趨化因子的釋放以及氧化損傷，可增加脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺組織sirtuin1(SIRT1)和Nrf2的表達，結(jié)果表明，NBP能以SIRT1依賴和SIRT1非依賴的方式激活Nrf2抗氧化信號，從而減輕氧化應(yīng)激、炎癥和肺水腫，即有望達到治療BPD的目的。

新生大鼠的肺對應(yīng)于肺發(fā)育的囊狀階段和青春期前的人肺發(fā)育階段，表現(xiàn)為總谷胱甘肽和過氧化氫增加，DNA和脂質(zhì)氧化損傷，以及對高氧反應(yīng)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)第二階段介質(zhì)(超氧化物歧化酶、血紅素氧合酶-1和Nrf2/Keap1系統(tǒng))的誘導(dǎo)。Endesfelder等[29]的動物實驗表明，除了腺苷受體的藥理拮抗作用外，咖啡因可能是一種有效的抗氧化劑，其減少氧化脫氧核糖核酸損傷，對氧化應(yīng)激反應(yīng)有保護性干擾，并調(diào)節(jié)高氧誘導(dǎo)的肺氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而在BPD相關(guān)動物模型中具有保護作用。

間充質(zhì)干細胞(MSCs)在許多人類疾病的治療中有著廣闊的前景，其具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性，胎兒來源的人胎盤間充質(zhì)干細胞(HfPMSCs)具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用。Yan等[30]采用hfPMSCs的細胞共培養(yǎng)模型和條件培養(yǎng)液(CM)，通過檢測hfPMSCs清除氧化劑和自由基的能力以及保護肺泡上皮細胞免受抗氧化損傷的能力來檢測hfPMSCs的抗氧化活性，結(jié)果表明，100 μM的維生素C具有一定的抗氧化能力，在單層和跨孔共培養(yǎng)模型中，CM單獨和共培養(yǎng)的hfPMSCs均顯示出保護A549肺泡上皮細胞免受600 μM過氧化氫(H2O2)暴露的氧化損傷的作用，與單純對照組相比，hfPMSCs及其CM可顯著降低HO誘導(dǎo)的肺泡上皮A549細胞的凋亡率，同時增加抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、NRF-2和HO-1的表達，降低促凋亡蛋白Bax、caspase 3和Keap1的表達。此外，從培養(yǎng)的hfPMSCs-CM中發(fā)現(xiàn)Nrf2/Keap1/ARE信號通路被抑制，導(dǎo)致A549細胞中caspase-3的表達顯著降低，盡管加入Nrf2抑制劑ML385，仍對hfPMSCs-CM的抗氧化活性沒有影響。這些研究數(shù)據(jù)表明，hfPMSCs至少部分地通過調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1-ARE信號介導(dǎo)的細胞凋亡來保護HO誘導(dǎo)的細胞氧化損傷。

另外，小干擾RNA(siRNA)可抑制A549細胞中Nrf2的表達，抑制miR-125b的表達，并顯著增加細胞凋亡率，提示miR-125b作為Nrf2的下游靶點有助于保護BPD[20]。McGrath-Morrow等[31]發(fā)現(xiàn)，Nrf2的激活提高了高氧暴露下新生小鼠的存活率，這可能是由于抗氧化反應(yīng)基因的表達增加所致，盡管Nrf2的激活誘導(dǎo)了抗氧化基因的表達，但并不能減輕暴露于高氧所致的肺泡生長停滯。

4 Nrf2及其相關(guān)藥物在其他疾病中的應(yīng)用

Zheng等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松治療哮喘的機制是通過調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2通路，從而抑制哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激水平。Keap1-Nrf2通路可以影響下游抗氧化反應(yīng)元件的表達。中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑對體內(nèi)細胞氧化應(yīng)激的抑制作用可能的潛在機制是激活Keap1/Nrf2信號通路。

質(zhì)膜結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體(TGR5)可通過促進Keap1-Nrf2信號通路的激活，有效減輕肝臟缺血再灌注損傷時的炎癥反應(yīng)，在多種肝病中起保護作用，這可能在減少相關(guān)炎癥分子、調(diào)節(jié)固有免疫方面有一定意義[33]。

槐苷(SOP)是從槐籽中分離得到的一種異黃酮苷，具有抗癌、抗過敏、抗炎等多種藥理活性，Wu等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，SOP以AMPK/Nrf2依賴的方式減輕LPS誘導(dǎo)的ALI，提示SOP可能是治療ALI/ARDS的潛在候選藥物。

Ali等[35]探討了馬兜鈴酸(CNT)在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中的抗炎作用，CNT誘導(dǎo)Nrf2蛋白的表達，分子對接研究顯示，其與Nrf2、P65、Keap1、HO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α和COX-2有顯著的結(jié)合作用，并表現(xiàn)出良好的物理化學(xué)性質(zhì)，CNT對LPS誘導(dǎo)的肺損傷有明顯的保護作用，并能改善動物的行為、生化和組織學(xué)指標(biāo)。

研究顯示，Nrf2依賴基因Pparg可編碼過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)[36]，PPARγ可對抗炎癥引發(fā)的內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白，在調(diào)節(jié)基因介入的炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要，而PPARγ的表達取決于 Nrf2。研究證實，抑制小窩蛋白酪氨酸殘基14磷酸化可增加Nrf2的核內(nèi)表達，從而增加其效應(yīng)分子PPARγ及claudin-5的表達，這對減輕肺組織炎癥、降低肺毛細血管旁滲透性具有十分重要的意義。

吳燦等[37]研究顯示，銀杏內(nèi)酯B對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化具有明顯的防治作用,其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1和Bcl-2/Bax途徑發(fā)揮作用，提示Nrf2在減輕大鼠肝纖維化方面的意義。

此外，Nrf2為腎臟疾病、肝臟疾病、心腦血管疾病、風(fēng)濕疾病等諸多疾病的治療提供新的治療靶點[38-45]。其激活藥物富馬酸二甲酯目前在多發(fā)性硬化癥的治療中被批準(zhǔn)應(yīng)用[46]。

5 展望

綜上所述，很多研究證實了Nrf2及其通路在BPD的作用，有望提供新的治療靶點，但是目前研究尚不充分,且停留在動物實驗水平，需要進一步的研究來證明Keap1/Nrf2信號通路在BPD的潛在機制。Nrf2已成為一個重要的預(yù)防和治療靶點，許多天然和合成化學(xué)物質(zhì)被認為是其調(diào)節(jié)劑,然而，越來越多的證據(jù)表明,Keap1-Nrf2-ARE調(diào)節(jié)的復(fù)雜程度遠超于此，并且還涉及其他分子機制[10]。Nrf2在新生兒疾病領(lǐng)域的研究尚且不足，Nrf2和Keap1的表觀遺傳調(diào)控將成為未來研究的一個重要方向。我們需要更多的研究對目前可用的Nrf2誘導(dǎo)劑和抑制劑進行嚴格評估，探索Nrf2及其通路的調(diào)控措施，探索更成熟易檢測的標(biāo)志物，以期能夠增加BPD的治療靶點。