Xpert Ultra超敏結核分枝桿菌基因檢測技術的臨床應用

天津市海河醫院（300222）韓東

1 概述

結核病(T B)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染所造成的傳染性疾病，在全球感染人數眾多，我國不但是全球結核病嚴重流行的國家之一，同時也是耐多藥結核病(MDR-TB)嚴重流行的國家[1]。結核病主要的診斷方法包括抗酸桿菌涂片染色鏡檢法和結核分枝桿菌培養法。抗酸染色鏡檢法應用廣泛，快速經濟，但靈敏度較低；結核分枝桿菌培養法為結核病診斷的金標準，但耗時較長，無法快速獲得結果，往往延誤疾病的診治。

在過去的幾十年里，使用聚合酶鏈反應（polyrnerase chain reaction，P CR）從臨床標本中直接檢測結核分枝桿菌的DNA，使結核病的微生物診斷技術水平得到了顯著地提高。Xpert MTB/RIF (Xpert)檢測技術是一種以聚合酶鏈反應(PCR)原理為基礎的體外診斷技術，通過核酸提取、擴增和檢測，將處理后的待檢標本放入密閉的反應盒中，通過上述三位一體操作程序自動檢出痰標本是否菌陽、荷菌量多少，以及是否對利福平耐藥。這極大地縮短了檢測時間， 可以使確診患者更早的應用抗結核藥物[2]，Xpert 比抗酸桿菌涂片染色鏡檢法更敏感、特異性更高，被世界衛生組織(WHO)推薦為結核病的快速診斷方法[3]，但是Xpert同樣也存在著許多的不足，由于Xpert的檢測限（LOD）為131菌落形成單位(cFU)／ml，相較于培養的LOD僅為1-10(cFU)／ml，其敏感性低于結核菌培養，除此之外Xpert的利福平耐藥性檢測還會出現假陽性的結果[4][5]。因此在2017年3月WHO推薦了一種新的檢測方法Xpert Ultra，這種檢測方法對結核分枝桿菌DNA檢測的敏感性更高，rpoB基因突變檢測的特異性更強，顯著提高了結核病的診斷水平。本文通過分析最新研究結果，比較了Xpert和Xpert Ultra在不同結核病發病地區以及不同發病部位中的表現，來討論Xpert Ultra在臨床工作中的的應用。

2 Xpert Ultra在肺結核診斷中的應用

2.1 敏感性 一項通過對五個國家的回顧性研究，比較了277例呼吸道標本中結核分枝桿菌的檢測結果，在培養陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性分別為88.7%和81%，在涂片陽性培養陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是98.9%和97.8%，在涂片陰性培養陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是78.9%和66.1%。在一項包括2368名參與者的前瞻性多中心研究中，在培養陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性分別為88%和83%，涂片陰性培養陽性的標本中Xpert Ultra和xpert的敏感性是63%和46%[6]。這些數據顯示在涂片陽性標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性無明顯差異，但在涂片陰性標本中Xpert Ultra的靈敏度更高。在結核病低流行地區進行的一項研究也得到了類似的結果，培養陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性是95.7%和82.9%，涂片陽性培養陽性的標本中Xpert Ultra和Xpert的敏感性都是100%，涂片陰性培養陽性的標本中Xpert Ul tra和Xpert的敏感性是91.8%和66.7%，這表明Xpert Ultra對含菌量低標本的敏感性更高。這一優勢有助于提高例如粟粒性結核、結核性胸膜炎、結核性腦膜炎或早期結核菌感染等情況下，含菌量較低的臨床標本的診斷率[7]。尤其在HIV感染患者中，結核病患病率及死亡率均高于普通人群[8][9]，因此對于此類患者結核菌感染的檢測十分重要。一項研究觀察到，在HIV陰性患者中，Xpert Ultra和Xpert的敏感性為別91%和90%，并無顯著差異，但在HIV陽性患者中，Xpert Ultra的敏感性仍維持在90%，Xpert的敏感性卻下降到了77%[6]。在另外一項研究中也同樣發現，HIV陰性患者中，Xpert Ultra相較于Xpert并無顯著優勢，但在HIV陽性患者中，Xpert Ultra的敏感性增加了11.7%[10]，更高的檢測敏感性可以幫助患者更早地接受抗結核治療，降低致死率。

兒科病人的敏感性：對于兒童人群的結核病診斷十分具有挑戰性。在一項包含453名符合條件兒童的研究中，Xpert Ultra對于呼吸道標本的敏感性和特異性分別為75.3%和96.9%[11]。對于感染HIV的兒童和未感染者HIV的兒童，Xpert Ultra的敏感性相似；在這項研究中，HIV的感染率為19.4%。不同的參考標準會得到不同的結果，當以呼吸道標本的培養結果作為參考時，Xpert Ultra和Xpert在呼吸道標本上測定的靈敏度分別為65.8%和64.4%。當以包含Xpert、Xpert Ultra、培養以及臨床資料的綜合信息作為參考時，Xpert Ultra的敏感性為73.7%，高于Xpert的63.2%[13]。在坦桑尼亞的另一項包含兩個中心研究中，培養陽性標本的Xpert Ultra靈敏度達到64.3%，相比于Xpert 的53.6%，Xpert Ultra在靈敏度上更為領先。同時在所有可用的標本中，相當于平均每個病人2.46和2.11個樣本，Xpert Ultra和Xpert的靈敏度分別為75%和60.7%[12]。對于這兩種檢測方法，僅檢測首次標本時，特異性均為100%；但對于所有測試標本，Xpert Ultra的特異性為98.1%；Xpert的特異性仍為100%。在HIV未感染患者中，Xpert Ultra和Xpert的敏感性并沒有顯著差異，分別為52.6%和47.4%。相反的，在HIV感染患者中，Xpert Ultra的敏感度為88.9%，明顯高于Xpert 66.7%的敏感度。這項研究表明，與Xpert相比，Xpert Ultra的敏感性更高，尤其是在HIV陽性的兒童患者中，而這部分兒童患者可以占到所有研究患者總數的52%，比例相當的高[12]。

2.2 特異性 在結核病高發病率地區進行的幾項研究表明，以結核菌培養結果為參照標準，與Xpert相比，Xpert Ultra的敏感性雖然增加，但與Xpert 98.7%的特異性相比，Xpert Ultra的特異性略有降低至96%[8]。基于聚合酶鏈反應可以檢測到標本中在抗結核藥物治療后殺死的結核桿菌以及既往存在結核病史患者殘存的結核菌DNA，因此無法區分標本中的結核菌是死的桿菌還是活的桿菌，從而影響測試特異性的準確性[13][14][15]，而這種情況更可能發生在檢測敏感性更高的Xpert Ultra中，這也解釋了為何其特異性較Xpert略低。此外，與肺結核低發病率的地區相比，高發病率地區由于患者既往肺結核病史發生率更高，從而更容易導致檢測特異性的降低[8][16]。Xpert Ultra的檢測結果在原來Xpert的“高、中、低、極低”4個級別的基礎上增加了“微量”，共5個級別。Xpert檢測中不存在“微量”這個類別，與該類別相對應的是多拷貝基因IS6110和IS1810陽性以及單拷貝基因rpoB陰性的PCR樣本，“微量”類別的出現是LOD提升的結果，會導致檢測特異性降低。Xpert Ultra檢測中“微量”結果表示檢測到極少量結核分枝桿菌DNA，有助于區分以前感染的死桿菌和正在進行的活動性肺結核，但需要注意的是當檢測值為“微量”時，利福平的耐藥性無法判斷，這與Xpert Ultra的耐藥性檢測機制相關。

3 Xpert Ultra在肺外結核診斷中的應用

許多研究都表明Xpert對于肺外結核的診斷結果可能會因為被測樣本的不同而有所不同。最近的一項關于Xpert的研究表明：腦脊液檢測結核菌的敏感性和特異性為71.1%和98%，胸腔積液的敏感性和特異性分別為50.9%和99.2%，而尿樣的敏感性和特異性為82.7%和98.7%[17]。到目前為止，有關Xpert Ultra對肺外結核診斷的研究還比較少。其中一項研究只選擇了涂片陰性的標本進行研究，其標本總體敏感性和特異性分別為75.9%和100%，另外的研究[18][19]顯示在含菌量較低的標本中，胸腔積液的敏感性僅為60.5%，其他部位的標本中腦脊液的敏感性為100%（3/3），關節液的敏感性為87.5%（7/8），腹腔積液的敏感性為33.3%（1/3），心包積液的敏感性為66.6%（2/3），尿液標本的敏感性為100%（12/12）。在這個研究中所有被檢測標本的特異性均為100%。然而，由于樣本數量較少，本文所得到的結果需要通過包含更多樣本的研究去進一步驗證。在一項包括200例肺外結核患者的回顧性研究中，Xpert Ultra和Xpert的總體敏感性分別為83.7%和67.4%，特異性為92%和96%，研究中包括103例胸腔積液標本，其中Xpert Ultra和Xpert的檢出率分別為43.7%和20.4%，研究中還包括71個組織穿刺標本，Xpert Ultra和Xpert的檢出率分別為78.9%和63.4%，略高于胸水。在另外一項包含108名患者的研究中，其胸腔積液樣本的Xpert Ultra和Xpert敏感性分別為61.11%和34.26%。國內關于Xpert Ultra對于肺外結核標本的檢測研究還比較少見，但先前的一系列關于Xpert在肺外結核標本中的研究[20][21]均顯示其敏感性不足。

結核性腦膜炎是一種危及生命的肺外結核疾病，對于它的診斷仍然非常具有挑戰性，延誤診治會導致死亡率增高，在艾滋病感染患者中尤其明顯[22]。由于結核性腦膜炎是一種含菌量較低的結核感染，所以對于腦脊液的微生物診斷敏感性不高。最初Xpert Ultra和Xpert并不被推薦應用于腦脊液的微生物檢測，但一些研究也在嘗試兩者在腦脊液中的應用，在一項包含43例HIV陰性結核性腦膜炎患者的研究中，Xpert的敏感性為18.60%，而Xpert Ultra的敏感性較Xpert提高了44.19%。在另一項包含23例HIV陽性結核性腦膜炎患者的研究中，Xpert Ultra和Xper的敏感性分別為70%和43%。同時這項研究還強調結核性腦膜炎的腦脊液結核菌培養陽性率非常低[23]。在這項研究中，只使用了1ml離心的腦脊液用于Xpert和Xpert Ultra檢測，而微生物診斷與標本得量是呈正相關的，但在實際工作中常常無法獲得大量的腦脊液標本，這也是結核性腦膜炎診斷具有挑戰性的另一個原因。國內的另一項研究表明，在同樣使用1～2ml腦脊液標本進行檢測時，Xpert Ultra的檢測敏感性顯著高于Xpert，這也表明Xpert Ultra更適用于實際臨床工作中。

總之，這些數據表明Xpert Ul tra較Xpert對于肺外結核的診斷敏感性更高。然而值得注意的是，這些測試結果在不同標本中存在較大差異，且由于研究的數量以及其包含的樣本數量均有限，其準確性仍需要更多的樣本去進一步驗證。

4 利福平耐藥檢測

Xpert的主要局限性是在利福平耐藥性檢測中出現的假陽性結果，研究發現在MDR-TB<5%以及MDR-TB>15%范圍內利福平耐藥檢測陽性預測值在70%～90%之間[4][24]，這是因為利福平耐藥性的檢測依賴于rpoB基因81 bp區域特異性DNA探針的缺失突變，而這種突變更容易出現在含菌量較少的樣本中。在Xpert Ultra中，檢測原理由半定量半巢式循環閾值的比較變為半定量巢式聚合酶鏈反應，運用了高分辨率熔解曲線技術，可更好地區分ropB突變種類，因此提高了利福平耐藥性檢測的準確性，降低了假陽性結果的幾率[6]。

由于兩種測試都針對單拷貝基因rpoB，Xpert Ultra和Xpert檢測利福平耐藥的靈敏度相似（92.7%～95%），同時Xpert Ultra對利福平耐藥檢測的特異性為98%和Xpert 99%的特異性并沒有顯著差異[8]。所以我們有必要對更多含菌量較低，相應的也包含DNA含量更低的結核分枝桿菌標本進行研究，以評估新的耐藥檢測技術的可靠性。

5 結論

Xpert以及最近出現的Xpert Ultra正在被越來越多的應用于臨床工作中，仔細了解這兩種檢測方法的優勢及其局限性十分重要，本文對比較Xpert Ultra和Xpert兩種檢測技術性能的相關文獻進行了回顧。Xpert技術擁有較高的敏感度和特異性，可以精準、迅速地檢測出利福平耐藥基因（ropB突變基因），在臨床上對結核病的診斷上發揮了重要的意義，同時顯著提升了利福平耐藥性和MDR-TB 的檢測水平，不足的是雖然Xpert檢測痰標本總的敏感度很高，但對含菌量較少的標本檢測的敏感度較低。Xpert Ultra將檢測目的基因ropB的5條探針增加到6條探針，降低了Xpert MTB/RIF Ultra的LOD，使其接近于培養，提高了在菌量較少情況下的敏感性，因此Xpert Ultra的整體靈敏度高于Xpert，尤其對結核性胸膜炎和菌陰結核等含菌量較低標本[8][21]。

作為一種基于PCR的檢測方法，在既往結核病病史患者的非活動結核桿菌中，Xpert Ultra仍能夠檢測出相應DNA，這種假陽性結果的出現會導致檢測特異性降低，而這種特異性降低在結核病高發地區更容易出現[11]，所以在臨床工作中遇到結核病復治的患者，需要全面地分析患者的病史、癥狀、體征、影像學檢查以及其他實驗室檢查等，不能單獨以Xpert Ultra結果確定患者是否存在活動性。

到目前為止，評估Xpert Ultra肺外結核診斷價值的文獻相對較少，涉及的樣本數量也相對有限，絕大多數的研究對象大多是呼吸道標本，因此對于呼吸道以外標本進行檢測，其結果的準確性及參考價值仍需謹慎對待。

對于利福平耐藥性進行的研究并未發現Xpert Ultra在檢測敏感性以及特異性方面有所提高。由于PCR檢測的目標基因仍然是單拷貝基因rpoB，并未預期其在敏感性方面能有所提高，但相比之下，由于引入了高分辨率熔解曲線技術，預計其特異性會有所提高，但和Xpert之間仍未出現明顯差異，造成這種結果的原因可能是由于Xpert Ultra技術的檢測優勢在含菌量較低標本中更加明顯，相應的也就是在耐多藥結核病發病率低的地區，而迄今為止，大多數研究都是在耐多藥結核病發病率較高的地區進行的。

綜上所述，Xpert Ultra在HIV陽性肺結核、結核性腦膜炎或結核性胸膜炎等標本含菌量較低的情況下，對于結核病診斷敏感性顯著提高。Xpert Ultra技術總體提升了結核病的診斷水平，但是需要注意的是陰性的Xpert Ultra檢測結果仍不能完全排除結核病。盡管結核菌培養同樣存在假陰性的情況，但培養仍是結核病診斷的重要參考指標之一。因此，臨床工作中需要結合患者的臨床特點，微生物學檢測結果以及諸如Xpert Ultra這類新的PCR檢測技術的結果綜合分析，使結核病的診斷更加可靠。