α-硫辛酸對白細胞介素1β 誘導的軟骨細胞損傷的保護作用

鄧慧琳，楊婧，郭俐

類風濕關節炎（RA）影響全球約1%的人口健康，是世界各國普遍關注的健康問題和經濟問題。研究顯示，α-硫辛酸在白細胞介素1β（IL-1β）誘導的軟骨細胞模型中發揮抗炎作用，對骨關節炎軟骨細胞損傷具有保護作用，但其作用機制尚未完全闡明。近年來，微小RNA（miRNA）因其廣泛參與增殖、凋亡、炎癥和免疫等生物學和生物學過程而受到廣泛關注。例如，在Ⅱ型膠原誘導的RA 大鼠模型中，微小RNA-26a（miR-26a）的表達下調，上調miR-26a 可以減輕軟骨損傷，刺激細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡；微小RNA-23a（miR-23a）通過抑制核因子κB 激酶抑制劑（IKKα）表達抑制RA 軟骨細胞的炎癥反應。微小RNA-877-5p（miR-877-5p）是miRNA 家族成員之一，研究發現，在阿司匹林所致的人胃黏膜上皮細胞損傷中miR-877-5p 表達上調，抑制miR-877-5p 表達能夠減輕阿司匹林所致胃黏膜上皮細胞損傷。N-myc下游調節基因2（NDRG2）隸屬于NDRG 基因家族的成員，與骨發育密切相關。研究發現，TNF-α刺激人類風濕性關節炎滑膜細胞可降低細胞中NDRG2 的蛋白水平。生物信息學分析顯示，NDRG2 是miR-877 的潛在靶基因，但α-硫辛酸和miR-877-5p 對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的影響，以及α-硫辛酸能否通過調控miR-877∕NDRG2 表達影響IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷目前還尚未可知。因此，本研究以IL-1β 誘導的軟骨細胞模擬RA 軟骨細胞損傷模型，分析α-硫辛酸對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的影響，初步探索其可能的分子機制，以期為α-硫辛酸在RA 的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本研究于2019 年1 月至2019 年7月在南充市中心醫院風濕免疫科實驗室完成。8只（4周齡）SPF級雄性SD大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；IL-1β 購自美國Sigma 公司；α-硫辛酸（CAS 號：1077-28-7；純度：BR，99%）購于上海源葉生物技術有限公司；杜爾伯格氏伊戈爾培養基（DMEM）和胎牛血清購于hyclone 公司；聚合酶鏈式反應（PCR）引物、miRNA模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-877 模擬物（mimics）、miRNA 抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、miR-877 抑制物（anti-miR-877）、NDRG2 野生型熒光素酶報告載體（WT-NDRG2）和NDRG2突變型熒光素酶報告載體（MUT-NDRG2）的構建和測序由北京華大基因公司提供；Trizol 試劑、放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液、蛋白質印跡（Western）封閉液、洗滌液均購于上海碧云天公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）∕碘化丙啶（PI）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購于武漢艾美捷科技有限公司；兔源B 細胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）單克隆抗體、兔源Bcl相關X蛋白（Bax）多克隆抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔Ⅱ抗購于Abcam 公司；鼠源NDRG2 單克隆抗體和HRP 標記的羊抗鼠Ⅱ抗購于Santa Cruz公司。

1.2 大鼠膝關節軟骨細胞分離及培養

取8只SPF級SD 大鼠，麻醉處死后，無菌條件刮取膝關節關節軟骨，經2 g∕L的Ⅱ型膠原酶消化處理4 h，分離軟骨細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基進行體外培養。

1.3 細胞分組和處理

將同一批次生長良好的第二代關節軟骨細胞以2×10個∕孔接種到6 孔板，采用隨機數字表隨機分為Con 組（正常培養的軟骨細胞）、IL-1β組（用含10 ng∕mL的IL-1β的細胞培養液處理，構建軟骨細胞損傷模型）、IL-1β+ALA-L組（用含10 ng∕mL 的IL-1β 和0.1 μmol∕L 的α-硫辛酸的細胞培養液處理）、IL-1β+ALA-M組（用含10 ng∕mL的IL-1β和1 μmol∕L的α-硫辛酸的細胞培養液處理）、IL-1β+ALA-H組（用含10 ng∕mL的IL-1β和10 μmol∕L的α-硫辛酸的細胞培養液處理）、IL-1β+anti-miRNC 組（轉染anti-miR-NC 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β細胞培養液處理）、IL-1β+anti-miR-877組（轉染antimiR-877 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 細胞培養液處理）、IL-1β+pcDNA 組（轉染pcDNA 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 細胞培養液處理）和IL-1β+pcDNANDRG2 組（轉染pcDNA-NDRG2 后，用含10 ng∕mL的IL-1β細胞培養液處理）。干預處理時間為48 h。為進一步驗證α-硫辛酸是通過調控miR-877 ∕NDRG2 通路進而影響IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷，把miR-NC和miR-877 mimics分別轉染軟骨細胞后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 和10 μmol∕L 的α-硫辛酸的細胞培養液干預處理，標記為IL-1β+ALA+miR-NC組和IL-1β+ALA+miR-877組，并進行后續分析。建模IL-1β濃度參考文獻［9］，α-硫辛酸濃度梯度設定參考文獻［10］。

1.4 qRT-PCR檢測

收集按照“1.3”進行相應干預處理的各組軟骨細胞，經PBS 液漂洗后，利用Trizol 試劑于冰上提取總RNA，逆轉錄為cDNA 后，以cDNA 為模板進行qPCR 擴增。分別以U6 和GAPDH 為內參基因，按照2法計算miR-877 和NDRG2 mRNA的相對表達量。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集按照“1.3”進行相應干預處理的各組細胞，用預冷的PBS 液洗滌細胞，離心棄去上清液，用1×Binding Buffer 重懸細胞，調整細胞密度為1×10個∕mL。取100 μL細胞懸液加入流式管內，再加入5 μL 的Annexin V-FITC，混勻后，室溫避光孵育10 min，加入5 μL的PI染液，繼續孵育5 min 后，補加PBS 至500 μL，輕輕混勻后，進行上機檢測。

1.6 試劑盒檢測IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量

收集1.3進行相應干預處理的細胞培養液，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟進行。

1.6.1 蛋白質印跡法檢測蛋白表達情況 收集按照“1.3”進行相應干預處理的各組細胞，經PBS漂洗后，離心棄取上清液，用適量預冷的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，按照1∶4比例加入5×蛋白上樣緩沖液，混勻后，煮沸3～5 min使細胞蛋白變性；取30 μg 蛋白樣品上樣進行SDSPAGE 凝膠電泳；電泳結束后，進行常規濕法轉膜（PVDF）；轉膜結束后，加入Western 封閉液室溫條件封閉1 h；Western洗滌液漂洗10 min，漂洗3次，加入已稀釋的NDRG2（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）以及GAPDH（1∶2 500）Ⅰ抗室溫孵育2 h；Western 洗滌液漂洗10 min，漂洗3 次；加入Ⅱ抗室溫孵育1 h；Western洗滌液再次洗膜后，進行ECL顯影；Image J軟件分析目的條帶灰度值（以GAPDH為內參）。

1.6.2 雙熒光素酶報告基因實驗 利用生物信息軟件對miR-877 的靶基因進行預測，發現miR-877與NDRG2 能夠特異性結合，猜測NDRG2 是miR-877 的靶基因，并進行驗證。構建野生型WTNDRG2和突變型MUT-NDRG2的NDRG2-3’UTR熒光素酶報告基因載體，利用Lipofectamine2000 將miR-877 mimics 和miR-NC 分 別 與WT-NDRG2 和MUT-NDRG21 共轉染軟骨細胞，培養48 h 后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.7 統計學方法

利用SPSS 20.0學軟件進行統計學分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，之后組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響

與Con組比較，IL-1β組軟骨細胞促炎因子IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低，促凋亡蛋白Bax 的表達升高，細胞凋亡率升高；與IL-1β組比較，IL-1β+ALA-L組、IL-1β+ALA-M組和IL-1β+ALA-H 組軟骨細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌降低，Bcl-2蛋白的表達升高，Bax蛋白的表達降低，細胞凋亡率降低，且隨著α-硫辛酸濃度的增加，細胞凋亡率逐步降低（P＜0.05）。見表1。以上結果表明，IL-1β可誘導軟骨細胞損傷，α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用。

表1 α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響∕

2.2 α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-877和NDRG2表達的影響

圖1 和表2 顯示，與Con 組比較，IL-1β 組軟骨細胞miR-877 的表達水平升高，NDRG2 mRNA 和NDRG2 蛋白的表達水平降低；與IL-1β 組比較，IL-1β+ALA-L 組、IL-1β+ALA-M 組和IL-1β+ALA-H 組軟骨細胞miR-877 的表達水平降低，NDRG2 mRNA和NDRG2蛋白的表達水平升高，且隨著α-硫辛酸濃度的增加，miR-877 的表達水平逐漸降低，NDRG2的表達水平逐漸升高（P＜0.05）。以上結果表明，α-硫辛酸可抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞中miR-877的表達，促進NDRG2表達。

圖1 NDRG2蛋白免疫印跡圖

表2 α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-877和NDRG2表達的影響∕

2.3 miR-877靶向調控NDRG2的表達

利用生物信息學軟件預測miR-877 靶基因顯示，miR-877 和NDRG2存在部分連續的結合位點，見圖2A。表3顯示，與miR-NC和WT-NDRG2共轉染組相比，miR-877和WT-NDRG2共轉染組軟骨細胞的熒光素酶活性降低（P＜0.05）；與miR-NC和MUT-NDRG2共轉染組相比，miR-877和MUT-NDRG2共轉染組軟骨細胞的熒光素酶活性變化無統計學意義。圖2B顯示，與miRNC組比較，miR-877組軟骨細胞中NDRG2蛋白表達量顯著降低［（0.23±0.03）比（0.65±0.06），P＜0.05］；與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-877組軟骨細胞中NDRG2蛋白表達量顯著升高［（0.98±0.08）比（0.63±0.05），P＜0.05］。以上結果表明，NDRG2是miR-877的靶基因，miR-877可負性調控NDRG2的表達。

圖2 miR-877靶向調控NDRG2的表達：A為NDRG2的3’UTR序列中含有與miR-877互補的核苷酸序列；B為NDRG2蛋白免疫印跡（WT-NDRG2為野生型NDRG2熒光素酶報告載體，MUT-NDRG2為NDRG2為突變型NDRG2熒光素酶報告載體）

2.4 抑制miR-877 表達對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的影響

表4和圖3顯示，與Con組比較，IL-1β組軟骨細胞miR-877的表達水平升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌增加，Bcl-2 蛋白的表達水平降低，Bax蛋白的表達水平升高，細胞凋亡率增加；與IL-1β+anti-miR-NC 組相比，IL-1β+anti-miR-877 組軟骨細胞miR-877 的表達水平降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌減少，Bcl-2 蛋白的表達水平升高，Bax 蛋白的表達水平降低，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。表明，抑制miR-877 表達可減輕IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷。

表3 雙熒光素酶報告實驗∕

圖3 凋亡相關蛋白表達

2.5 NDRG2過表達對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響

表5和圖4顯示，與Con組比較，IL-1β組軟骨細胞NDRG2 蛋白的表達水平降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌增加，Bcl-2 蛋白的表達水平降低，Bax蛋白的表達水平升高，細胞凋亡率增加；與IL-1β+pcDNA 組比較，IL-1β+pcDNA-NDRG2 組軟骨細胞NDRG2蛋白的表達水平升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌減少，Bcl-2蛋白的表達水平升高，Bax蛋白的表達水平降低，細胞凋亡率減少（P＜0.05）。這表明，過表達NDRG2 可減輕IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷。

2.6 過表達miR-877 逆轉了α-硫辛酸對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的作用

表6 和圖5 顯示，與IL-1β 組比較，IL-1β+ALA 組軟骨細胞miR-877 的表達降低，NDRG2 蛋白的表達升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌降低，Bcl-2蛋白的表達升高，Bax蛋白的表達降低，細胞凋亡率降低；與IL-1β+ALA+miR-NC組比較，L-1β+ALA+miR-877組軟骨細胞miR-877的表達升高，NDRG2蛋白的表達降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌升高，Bcl-2蛋白的表達降低，Bax蛋白的表達升高，細胞凋亡率增加。表明，過表達miR-877能夠逆轉α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的保護作用。

表4 抑制miR-877表達對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響∕

表5 NDRG2過表達對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響∕

表6 miR-877過表達逆轉了α-硫辛酸（10 μmol∕L）對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的保護作用∕

圖4 NDRG2和凋亡相關蛋白免疫印跡圖

圖5 NDRG2和凋亡相關蛋白免疫印跡圖

3 討論

α-硫辛酸是一種天然存在的硫醇抗氧化劑，它不僅在糖尿病方面有廣泛的臨床應用，而且在心血管疾病和肝腎疾病中也有廣泛的應用。最近的研究表明，α-硫辛酸通過抑制IRF-1 的轉錄活性發揮抗炎作用，從而對IL-1β 誘導的軟骨細胞具有保護作用；α-硫辛酸還可增加牛油果和大豆非皂化物對體外培養的軟骨細胞的抗炎活性。此外，α-硫辛酸還可抑制NF-κB通路活化，抑制TNF-α分泌，對碘乙酸鈉誘導的骨關節炎大鼠軟骨細胞具有保護作用。本研究發現，α-硫辛酸呈濃度依賴性地抑制IL-1β誘導的軟骨細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌，抑制Bax 的表達，促進Bcl-2 的表達，抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡，發揮保護作用，這與Sun等的研究結論相一致。同時，本研究發現α-硫辛酸呈濃度依賴性地抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞miR-877的表達，促進NDRG2 表達。此外，雙熒光素酶報告基因實驗和western blot 檢測顯示，miR-877 可負性調控NDRG2 的表達。因此，推測α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞的保護作用可能與miR-877 ∕NDRG2分子軸的異常表達有關。

近年來，隨著對miRNA 研究的不斷深入，miRNA 與細胞凋亡、損傷的聯系越來越清晰。前人研究發現，miR-877參與多種細胞的凋亡過程，在X射線引起的視網膜神經節細胞損傷中，miR-877 表達上調，miR-877 通過調控其靶基因參與視網膜神經節細胞的放射損傷過程；同時，miR-877表達上調還參與曲伐沙星等多種藥物誘導的肝損傷過程；此外，下調miR-877表達對阿司匹林所誘導的胃黏膜細胞損傷具有保護作用。本研究發現，抑制miR-877 表達可抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌，降低Bax 的表達，增加Bcl-2的表達，抑制細胞凋亡。提示抑制miR-877表達與α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的保護作用一致。

NDRG 基因家族包括NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4四個家族成員，是近年發現的一類細胞內信號分子。NDRG2 基因定位于染色體14q11.2 位點，作為一種抑癌基因，NDRG2 基因的表達缺失與結腸癌、胃癌等惡性腫瘤的發生密切相關。同時，NDRG2 還可在應激條件下發生改變，影響細胞的生理和病理過程。在大鼠心肌缺血再灌注損傷中NDRG2 表達下調；在肺缺血再灌注損傷中，過表達NDRG2 可抑制炎性因子TNF-α、IL-6 表達，抑制病理組織的炎性改變。本研究發現，過表達NDRG2 可抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞炎性因子IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌，降低Bax的表達，增加Bcl-2的表達，抑制細胞凋亡。提示miR-877∕NDRG2分子軸參與對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的調控。為進一步驗證α-硫辛酸對調控miR-877∕NDRG2 分子軸對IL-1β誘導的軟骨細胞發揮保護作用，將miR-877轉染軟骨細胞，經IL-1β 誘導和α-硫辛酸干預處理后，發現miR-877過表達可逆轉α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響。提示，α-硫辛酸通過調控miR-877∕NDRG2通路對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用，在RA 等炎癥相關關節疾病的預防和治療中具有科研前景。

綜上所述，α-硫辛酸通過減弱炎癥反應，抑制細胞凋亡，對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用，其機制與調控miR-877∕NDRG2通路有關。本研究的發現為α-硫辛酸在RA的臨床應用奠定了理論基礎。