核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組基因1和人類X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌奧沙利鉑療效的相關(guān)性

李林子 ，李昌海，謝雄偉，劉晨暉，楊娥，韋智丹，廖秋霞

根據(jù)2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）在女性中是繼乳腺癌之后的第二大常見(jiàn)腫瘤，在男性中是繼肺癌、前列腺癌之后的第三大常見(jiàn)腫瘤，嚴(yán)重威脅著人民群眾的健康。當(dāng)前對(duì)于CRC的治療，化療仍然是其主要手段，其中以鉑類藥物（主要為奧沙利鉑）為基礎(chǔ)的化療方案是臨床上治療晚期CRC 常用的方案。然而，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，鉑類藥物的療效存在著個(gè)體化差異，這種差異與多種因素有關(guān)，其中個(gè)體的基因多態(tài)性就是其中主要因素，如DNA 修復(fù)能力增強(qiáng)、藥物解毒增加、以及鉑類DNA加合物增加等。

核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）途徑可以快速修復(fù)鉑類藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞中DNA所造成的損傷，改變腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐受性，進(jìn)而影響鉑類藥物的化療效果，該途徑是目前唯一明確的人類細(xì)胞針對(duì)鉑類藥物所造成的DNA 損傷修復(fù)機(jī)制。其中核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組基因1（ERCC1）和人類X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1（XRCC1）是NER系統(tǒng)中的最為重要的組成成分，兩者參與鉑類藥物引起的DNA 損傷修復(fù)過(guò)程。因此，本研究將探討ERCC1和XRCC1單核苷酸多態(tài)性（SNP）與接受以?shī)W沙利鉑為基礎(chǔ)的化療方案治療晚期結(jié)直腸癌（CRC）療效相關(guān)性，為指導(dǎo)晚期CRC的個(gè)體化化療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取荊門(mén)市第一人民醫(yī)院2017 年11月至2019年4月收治的確診為Ⅲ期和Ⅳ期（TNM分期）晚期結(jié)直腸癌化療病人。

入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）按照TNM分期，經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為Ⅲ期、Ⅳ期晚期結(jié)直腸癌病人；（2）具有可測(cè)量的實(shí)體病灶；（3）所有晚期結(jié)直腸癌病人之前未進(jìn)行過(guò)姑息性治療或既往使用過(guò)新輔助或輔助化療（不含奧沙利鉑）結(jié)束時(shí)間距離本次疾病復(fù)發(fā)時(shí)間超過(guò)了6 個(gè)月；（4）KPS 評(píng)分（Karnofsky 功能狀態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)）≥60；預(yù)計(jì)生存時(shí)間＞3個(gè)月；（5）化療前血常規(guī)、肝腎功能正常；（6）年齡≥18歲。本研究已報(bào)荊門(mén)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)（批號(hào)201802021），入選病人均征得其本人或直系家屬知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

選取的所有CRC 病人均接受以鉑類藥物（主要為奧沙利鉑）為基礎(chǔ)的化療方案（FOLFOX、CapeOX）進(jìn)行化療，其中采用FOLFOX方案（FOLFOX4方案27例，mFOLFOX6方案8例）有35例，采用CapeOX方案有60例，化療3個(gè)周期之后進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。

FOLFOX4 方案：第1 天奧沙利鉑85 mg∕m靜脈輸注2 h；第1、2 天靜脈輸注亞葉酸鈣200 mg∕m；第1天靜脈推注5-FU 400 mg∕m，第2天22h持續(xù)靜滴5-FU 600 mg∕m，每2 周重復(fù)，共24 周。mFOLFOX6方案：第1 天奧沙利鉑85 mg∕m靜脈輸注2 h，亞葉酸鈣400 mg∕m靜脈輸注2 h，5-FU 400 mg∕m靜脈推注，然后5-FU 1 200 mg·m·d×2 d 持續(xù)靜脈輸注（總量2 400 mg∕m，輸注46～48 h），每2周重復(fù)，共24周。CapeOX 方案：第1天奧沙利鉑130 mg·m靜脈輸注2 h，第1～14 天卡培他濱1 000 mg·m·次，每日2次，每3周重復(fù)，共24周。所有病例均在化療3個(gè)周期后對(duì)其進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。

1.3 樣本收集與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

收集病人臨床資料和血樣樣本并對(duì)其進(jìn)行定期隨訪，評(píng)價(jià)化療療效及不良反應(yīng)。

所有病人均至少完成3周期的化療后評(píng)價(jià)療效（腫瘤進(jìn)展除外），對(duì)病人進(jìn)行體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查。按實(shí)體瘤的療效標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）分為：完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進(jìn)展（PD），以CR+PR 為有效計(jì)算腫瘤控制率。化療藥物不良反應(yīng)評(píng)價(jià)參照WHO（1981年）標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 樣本基因分型檢測(cè)

本研究運(yùn)用熒光染色原位雜交測(cè)序檢測(cè)系統(tǒng)（TL998A型，西安天隆科技有限公司）對(duì)病人血液樣本中白細(xì)胞進(jìn)行基因分型檢測(cè)。

抽取2 mL靜脈血置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，富集血樣中的白細(xì)胞，向其中加入100 μL PHARM-GENE 01 SNP分析保存液，用移液槍吹打混勻后室溫靜置30 min，各取1 μL經(jīng)上述流程處理后的白細(xì)胞樣本分別加入ERCC1 Asn118Asn、XRCC1 Gln399Arg PHARM-GENE 200 SNP 試劑，震蕩混勻后置于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀中進(jìn)行基因分型檢測(cè)。

試劑來(lái)源：所有基因分型檢測(cè)試劑均購(gòu)置于北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用檢驗(yàn)分析樣本基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。采用χ檢驗(yàn)分析病人一般資料與晚期結(jié)直腸癌化療療效的關(guān)系；采用二元logistic 回歸分析對(duì)ERCC1 Asn118Asn和XRCC1 Gln399Arg基因多態(tài)性與含奧沙利鉑為基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌化療方案療效的關(guān)系（OR值，95%CI）進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因多態(tài)性分布

選取的95 例病例中，ERCC1 Asn118Asn 各基因型頻率分別為：AA 型9 例（9.5%），AG 型32 例（33.7%），GG 型54 例（56.8%）；XRCC1 Gln399Arg 各基因型頻率分別為T(mén)T 型4 例（4.2%），TC型41例（43.2%），CC型50例（52.6%）。經(jīng)Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)，基因型ERCC1 Asn118Asn（χ＝1.64，P＞0.05）、XRCC1 Gln399Arg（χ＝1.54，P＞0.05）在這些樣本群體中的分布符合遺傳平衡，沒(méi)有明顯偏離分布，說(shuō)明本研究資料具有群體代表性。

2.2 化療療效分析

2.2.1 臨床資料統(tǒng)計(jì)和療效相關(guān)性 CR、PR、SD、PD 分別為5、33、31、26 例，總有效例數(shù)38（CR+PR）例，總有效率為40.0%。所選病人性別、年齡、TNM分期、腫塊部位（結(jié)腸部位、直腸部位）、化療方案（FOLFOX4、mFOLFOX6、CapeOX）和化療療效均無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

2.2.2 病人基因型和療效相關(guān)性 選取的95 例CRC病例中，攜帶ERCC1 Asn118Asn GG、AG+AA基因型的病人化療后有效率分別為51.9%（28∕54）和24.4%（10∕41），ERCC1 Asn118Asn AG+AA基因型病人化療失敗的可能性是GG 型的3.338 倍（OR＝3.338，95%CI為1.370～8.134，P＜0.05）；攜帶XRCC1 Gln399Arg CC、TC+TT 基因型的病人化療后有效率分 別 為52.0%（26∕50）和26.7%（12∕45），XRCC1 Gln399Arg TC+TT 基因型病人化療失敗的可能性是CC 型之間的2.979 倍（OR＝2.979，95%CI 為1.257～7.060，P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表1 結(jié)直腸癌95例臨床資料以及療效分析

3 討論

化療的鉑類藥物在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后能與腫瘤細(xì)胞中的DNA 結(jié)合，形成Pt-DNA 螯合物，進(jìn)而導(dǎo)致DNA 鏈間或鏈內(nèi)發(fā)生交聯(lián)，從而引起DNA 復(fù)制障礙，抑制腫瘤細(xì)胞的分裂。NER 系統(tǒng)是人體中DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)最為重要的組成部分，研究表明鉑類藥物引起機(jī)體中的DNA 損傷主要由NER 系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，因此，不同個(gè)體中NER系統(tǒng)的差異可能是影響鉑類藥物療效存在個(gè)體化差異的重要因素。

ERCC1 基因是機(jī)體NER 系統(tǒng)中重要的DNA 損傷修復(fù)基因，其編碼的蛋白能與著色干皮病基因組F（XPF）蛋白形成異源二聚體復(fù)合物（ERCCl-XPF），該復(fù)合物在對(duì)DNA 損傷位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別和切除的過(guò)程中均起著關(guān)鍵性作用，能切除受損傷的寡核苷酸。然而，研究表明，人類機(jī)體中的ERCC1 基因存在著基因多態(tài)性，其中ERCC1 Asn118Asn（rs11615）位點(diǎn)的突變是該基因常見(jiàn)的SNPs，該位點(diǎn)突變可導(dǎo)致其表達(dá)的ERCC1蛋白水平下降，從而使機(jī)體中核酸切除修復(fù)能力顯著下降，進(jìn)而影響鉑類藥物療效的差異，該基因位點(diǎn)的突變也是ERCC1基因與鉑類藥物療效差異的主要研究位點(diǎn)。

表2 結(jié)直腸癌95例基因型和療效分析（n＝95）

XRCC1是影響細(xì)胞對(duì)射線輻射敏感的基因，也是NER系統(tǒng)中另一個(gè)重要的堿基切除修復(fù)基因，其編碼的XRCC1蛋白與DNA連接酶Ⅲ、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）和聚合酶β形成復(fù)合物，該復(fù)合物參與堿基切除修復(fù)（BER），能修復(fù)鉑類藥物等內(nèi)外因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA損傷，是BER通路的重要組成部分。研究表明，人體中XRCC1基因存在著基因多態(tài)性，其中XRCC1 Gln399Arg（rs25487）位點(diǎn)的突變研究最為廣泛，該突變位于XRCC1基因的功能區(qū)，導(dǎo)致的氨基酸改變對(duì)XRCC1 蛋白功能的影響最大，進(jìn)而影響XRCC1蛋白對(duì)受損DNA的修復(fù)能力，因此，理論推測(cè)該基因位點(diǎn)的突變將增強(qiáng)鉑類藥物化療的療效。

本研究結(jié)果表明，選取的95 例晚期CRC 病人中，ERCC1 Asn118Asn 和XRCC1 Gln399Arg 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。病人的性別、年齡、結(jié)直腸癌分期（TNM分期）、腫塊部位（結(jié)腸部位、直腸部位）和含鉑類藥物（主要為奧沙利鉑）為基礎(chǔ)的化療方案療效均無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。95 例CRC 病人中，攜帶ERCC1 Asn118Asn AA+AG 基因型病人化療失敗的可能性是GG 型的3.338 倍（OR＝3.338，95%CI：1.370～8.134，P＜0.05），攜帶XRCC1 Gln399Arg TC+TT基因型病人化療失敗的可能性是CC 型之間的2.979 倍（OR＝2.979，95%CI：1.257～7.060，P＜0.05）。提示ERCC1 Asn118Asn、XRCC1 Gln399Arg 基因多態(tài)性與CRC病人含奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療臨床療效有顯著相關(guān)性，此結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道一致。

綜上所述，機(jī)體NER 系統(tǒng)與含鉑類藥物（主要為奧沙利鉑）為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療療效差異存在密切相關(guān)性。ERCC1基因和XRCC1基因作為NER系統(tǒng)中的重要基因，其單核苷酸多態(tài)性（ERCC1 Asn118Asn、XRCC1 Gln399Arg）是不同個(gè)體對(duì)鉑類藥物化療療效差異的主要原因之一。檢測(cè)ERCC1 Asn118Asn、XRCC1 Gln399Arg單核苷酸多態(tài)性有利于指導(dǎo)和預(yù)測(cè)晚期結(jié)直腸癌病人接受含奧沙利鉑化療方案的化療療效，為結(jié)直腸癌病人的個(gè)體化化療提供理論依據(jù)。